柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中總黃酮、檸檬苦素和諾米林含量變化

曾竟藍(lán)，馬胤鵬，秦 丹，2，曾 璐*，陳長(zhǎng)松

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.天下果業(yè)開發(fā)有限公司，湖南 湘西自治州 416000）

柑橘酒具有酒精度低、酒質(zhì)溫和爽口的特點(diǎn)，基本保留柑橘原有風(fēng)味和功效，并且具有防衰抗老、潤(rùn)肺、補(bǔ)肝、安神等保健作用[1]。柑橘酒中存在多種功能性成分，如類胡蘿卜素、黃酮類化合物和類檸檬苦素等。柑橘中的類黃酮是一種具有C6-C3-C6苯并呲喃酮結(jié)構(gòu)的多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗病菌、抗炎、降低毛細(xì)血管脆性、抗過(guò)敏、抑制血小板凝集等多方面的藥理作用[2-3]。因此，柑橘酒中的黃酮含量可作為評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值的一個(gè)重要指標(biāo)。類檸檬苦素是一類高度氧化的四環(huán)三萜類化合物，常以苷元和配糖體存在，具有抗氧化性、抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌抗病毒等多種生物活性[4-6]。據(jù)報(bào)道，現(xiàn)已分離出類檸檬苦素苷元36種，類檸檬苦素糖苷17種，其中檸檬苦素（limonin）和諾米林（nomilin）最具代表性[7]。果汁中的A-環(huán)內(nèi)酯能在酸性條件下被檸檬苦素D-環(huán)內(nèi)脂水解酶催化形成檸檬苦素，產(chǎn)生果汁加工“后苦”的現(xiàn)象[8]，尤其在冰凍、機(jī)械損害這類非正常條件下的水果組織破壞，可增加果肉酸度和提高酶活，促使檸檬苦素生成量增加[9]。在柑橘果汁加工中，通常認(rèn)為檸檬苦素和諾米林為代表的苦味物質(zhì)閾值為6 mg/L，超過(guò)該質(zhì)量濃度則太苦而不宜用于飲料加工[10-11]。由此可知，檸檬苦素類似物雖具有多種生物活性，但它們帶來(lái)的苦澀味嚴(yán)重影響了柑橘酒的口感，制約著柑橘酒的發(fā)展[12-13]。因此，了解檸檬苦素類似物在柑橘酒釀造過(guò)程中的變化規(guī)律顯得尤為重要。

目前，有關(guān)柑橘酒的研究主要針對(duì)于產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味的提高，而其發(fā)酵過(guò)程中功能性成分的變化方面尚未見報(bào)道。基于此，本研究以實(shí)驗(yàn)室自釀的柑橘酒為試驗(yàn)材料，利用分光光度法和高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）法分別對(duì)柑橘果酒發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的總黃酮和苦味物質(zhì)（即檸檬苦素和諾米林）進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，分析其含量在發(fā)酵過(guò)程中的變化趨勢(shì)，為以期為柑橘酒中功能性成分含量的提高，以及柑橘酒的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘：湖南湘西椪柑；酵母：意大利SC果酒酵母；蔗糖：廣西貴糖集團(tuán)股份有限公司；氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸、硫酸、檸檬酸、二甘醇（均為分析純）、乙腈、磷酸（均為色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品、諾米林標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：成都曼斯特生物科技有限公司；橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYZ-E8型榨汁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；MJ-250B5-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LXJ-IIB型離心機(jī)：上海安寧科學(xué)儀器廠；PHS-3B型酒精計(jì)：翼州市耀華器械儀表廠；JA2003N型電子天平：上海箐海儀器有限公司；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PGSJ-3F型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；721型可見光分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；1260高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柑橘酒的加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：將鮮果處理好后榨汁去渣，得椪柑濁汁，調(diào)整初始糖度為24%，接種SC果酒酵母，接種量為0.04%，發(fā)酵溫度控制在21℃，主發(fā)酵1～2周，殘?zhí)橇康椭? g/L后，轉(zhuǎn)入后發(fā)酵，溫度控制在15℃以下，后發(fā)酵持續(xù)約一個(gè)月，使殘?zhí)墙抵? g/L以下。后發(fā)酵結(jié)束后，用四層紗布過(guò)濾，分離酒腳，溫度控制在15℃進(jìn)行陳釀3個(gè)月以上，在低溫條件下用棉餅（或硅藻土）過(guò)濾機(jī)過(guò)濾、裝瓶，得柑橘酒成品。

將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為鮮果、起酵、發(fā)酵旺盛、主發(fā)酵、后發(fā)酵這五個(gè)階段來(lái)取樣分析酒中各指標(biāo)的變化。

1.3.2 柑橘酒中總黃酮含量的測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[14]，以橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用分光光度法測(cè)定柑橘酒中總黃酮的含量。

1.3.3 柑橘酒中檸檬苦素和諾米林含量的測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定柑橘酒中檸檬苦素和諾米林的含量[15-16]。

樣品處理：準(zhǔn)確吸取柑橘酒5 mL于10 mL容量瓶中，以乙腈定容，搖勻，超聲處理20 min，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，平行制備3份待測(cè)液。

高效液相色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈∶0.1%磷酸水=55∶45（V/V）；柱溫35℃；流速1mL/min；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，波長(zhǎng)掃描范圍為200～400 nm。

檸檬苦素和諾米林的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取檸檬苦素和諾米林標(biāo)準(zhǔn)品各90 mg，用乙腈超聲輔助溶解并定容至100 mL，搖勻，配成質(zhì)量濃度均為90 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。再依次稀釋成0.9 mg/L、1.8 mg/L、4.5 mg/L、9.0 mg/L、18 mg/L、45 mg/L的檸檬苦素和諾米林系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)分別繪制檸檬苦素和諾米林標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 其他理化指標(biāo)的測(cè)定

酒精度：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計(jì)法；總糖：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法；總酸：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的指示劑法[17]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel和SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中總糖含量和酒精度的變化

圖1 柑橘果酒發(fā)酵過(guò)程中總糖含量和酒精度的變化Fig.1 Changes of total sugar content and alcohol contents in citrus wine during fermentation process

由圖1可知，發(fā)酵前3 d，發(fā)酵液中總糖含量的變化不大，可能因?yàn)榻湍妇鷦偨臃N處于菌體增殖起始期，酵母菌菌體數(shù)量在較低水平。觀察發(fā)酵液變化情況發(fā)現(xiàn)，第3天發(fā)酵液上層有少量氣泡產(chǎn)生而下層較平靜，進(jìn)入起酵期。此時(shí)，發(fā)酵液中總糖含量緩慢降低，酒精度緩慢增加。第6天發(fā)酵液中有大量氣泡產(chǎn)生，進(jìn)入發(fā)酵旺盛期。此時(shí)，發(fā)酵液中酵母菌的菌體數(shù)量呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，大量消耗糖分，發(fā)酵液中總糖含量急劇下降，酒精度含量快速上升。隨著發(fā)酵液中糖的消耗和酒精度的提高，酵母的生長(zhǎng)繁殖受到抑制，在第16天時(shí)，無(wú)明顯起泡現(xiàn)象，視為主發(fā)酵結(jié)束。此時(shí)發(fā)酵液中總糖含量為5.75g/L，酒精度為14%vol。在后發(fā)酵階段，發(fā)酵液中總糖含量較低且下降緩慢，酵母生長(zhǎng)繁殖活動(dòng)減弱，酒精度無(wú)顯著變化。第45天柑橘酒的后發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)發(fā)酵液中總糖含量為1.26 g/L，酒精度為14.7%vol。在整個(gè)發(fā)酵階段，酒精生成和糖降解速度呈現(xiàn)出一定的一致性。

2.2 柑橘酒中總黃酮含量的變化

不同柑橘種類含有的黃酮種類不同，本試驗(yàn)中所用湘西椪柑屬于寬皮柑橘，其中黃酮類物質(zhì)中黃烷酮含量較高，占黃酮總量的80%，且以橙皮苷為主[18]。因此，以橙皮苷為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定柑橘酒中總黃酮的含量。

2.2.1 橙皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以橙皮苷質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可知，橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.009 1x+0.007 4，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6，表明二者線性關(guān)系良好。

圖2 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of hesperidin

2.2.2 柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量的變化

圖3 總黃酮含量在柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中的變化Fig.3 Changes of total flavonoids contents in citrus wine during fermentation process

由圖3可知，柑橘鮮果中總黃酮含量較高，未發(fā)酵的橘汁中總黃酮含量高達(dá)1747mg/kg。在果酒的起酵階段，總黃酮含量變化緩慢，隨著發(fā)酵的開始總黃酮含量的變化速率加快。在發(fā)酵旺盛時(shí)期，隨著酵母菌的快速繁殖，酒精的大量生成，果酒中總黃酮含量顯著下降（P＜0.05），而在果酒主發(fā)酵結(jié)束后，總黃酮含量下降較緩慢，并趨于平穩(wěn)。在柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中，總黃酮的含量呈下降趨勢(shì)?？傸S酮含量在主發(fā)酵時(shí)期下降較明顯，主發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中總黃酮的含量下降到566.3 mg/kg，隨著主發(fā)酵的結(jié)束，發(fā)酵液中總黃酮含量的變化趨于穩(wěn)定，后發(fā)酵結(jié)束時(shí)柑橘酒中總黃酮含量為544.32 mg/kg。在柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中，柑橘酒總黃酮含量的降低一方面可能是由于酵母產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物（如丙酮酸、乙醛等）與黃酮類物質(zhì)反應(yīng)，生成一些大分子衍生物，而導(dǎo)致酒中總黃酮含量下降；另一方面可能是在發(fā)酵過(guò)程中，微生物產(chǎn)生一些酶使其發(fā)生降解，導(dǎo)致其水溶性降低，從而使酒中總黃酮含量下降[19]。盡管柑橘酒中總黃酮含量有所下降，但其含量顯著高于其他果酒如枸杞酒[20-21]、山楂酒[22]等，因此，仍具有較大的商品價(jià)值。

2.3 柑橘酒中檸檬苦素和諾米林含量的變化

柑橘酒中最常見導(dǎo)致苦味的萜類化合物是檸檬苦素和諾米林，與其他萜類化合物相比，其含量在果實(shí)中較高，也與柑橘加工“后苦味”有關(guān)[23]。因此，選擇檸檬苦素和諾米林兩種物質(zhì)為代表探究其在發(fā)酵過(guò)程中的變化。

2.3.1 檸檬苦素和諾米林的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)分別繪制繪制檸檬苦素和諾米林的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。由圖4可知，檸檬苦素和諾米林標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程分別為y檸=6.498 8x-0.095 2和y諾=6.498 8x-0.095 2，相關(guān)系數(shù)R2均為1，結(jié)果表明，檸檬苦素、諾米林在質(zhì)量濃度0.9～45mg/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，可以用于定量檢測(cè)。

圖4 檸檬苦素和諾米林的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curves of limonin and nomilin

2.3.2 柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中檸檬苦素和諾米林的變化

由圖5可知，柑橘汁中檸檬苦素含量很低，為2.21mg/L。從起酵過(guò)程中檸檬苦素含量顯著升高至15.65mg/L（P＜0.05），但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，檸檬苦素的含量逐漸減少，直到主發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液中檸檬苦素降至10.87 mg/L，在主發(fā)酵結(jié)束后，無(wú)顯著變化且趨于穩(wěn)定（P＞0.05），諾米林的變化規(guī)律與檸檬苦素類似。在起酵的過(guò)程中其含量顯著增加至3.37 mg/L（P＜0.05），進(jìn)入發(fā)酵旺盛期后小幅增加至3.55 mg/L。主發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中諾米林含量顯著減少至2.20 mg/L（P＜0.05），在后發(fā)酵時(shí)期逐漸趨于平衡。新鮮的柑橘中檸檬苦素類似物的含量極少，經(jīng)榨汁后柑橘中含有的A-環(huán)內(nèi)酯暴露在酸性環(huán)境中，快速地被檸檬苦素D-環(huán)內(nèi)脂水解酶催化水解，生成有苦味的檸堿[24-26]。因此，起酵時(shí)期發(fā)酵液中檸檬苦素、諾米林含量顯著升高（P＜0.05）。隨著發(fā)酵的進(jìn)行和酵母的繁殖，在主發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液中檸檬苦素和諾米林含量顯著降低，可能是由于酵母發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與其反應(yīng)，使其水溶性降低，發(fā)生沉降，導(dǎo)致發(fā)酵液中檸檬苦素、諾米林的含量降低。故而在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液中檸檬苦素與諾米林的含量逐漸減少，直至趨于穩(wěn)定。

圖5 檸檬苦素和諾米林在柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中的變化Fig.5 Change of limonin and nomilin in citrus wine during fermentation process

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了總黃酮、檸檬苦素和諾米林含量在柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中的變化。結(jié)果表明，在發(fā)酵過(guò)程中柑橘酒總黃酮呈持續(xù)下降的變化趨勢(shì)，主發(fā)酵結(jié)束后下降至566.3mg/kg，與原汁相比減少了67.58%。柑橘酒中檸檬苦素和諾米林均呈先增大后減小趨勢(shì)，起酵后含量達(dá)最高。經(jīng)發(fā)酵后酒中檸檬苦素和諾米林顯著下降（P＜0.05），發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別下降30.54%和34.72%。檸檬苦素、諾米林雖是柑橘酒中的重要功能性成分之一，但因其具有的“后苦味”，也是影響柑橘酒品質(zhì)的重要苦味物質(zhì)。因此，了解這些物質(zhì)在柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中的變化，有利于柑橘酒發(fā)酵工藝的改進(jìn)，同時(shí)也為低苦、高黃酮含量柑橘酒的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。