Surepath非婦科液基制片的經(jīng)驗分享*

劉念，李啟源，常櫻瑜，查俊梅， 蘇學(xué)英

20世紀50年代細胞學(xué)檢查方法開始應(yīng)用于宮頸癌篩查，大幅度降低了宮頸癌的發(fā)病率和死亡率。隨著液基細胞制片技術(shù)、高危型人類乳頭狀瘤病毒檢測，以及p16INK4a/Ki67免疫細胞化學(xué)雙染等檢查方法的應(yīng)用，宮頸癌篩查質(zhì)量不斷提高[1]。近年來液基制片技術(shù)逐漸應(yīng)用于各種非婦科細胞學(xué)樣本制備，然而液基制片技術(shù)及非婦科細胞學(xué)樣本種類繁多，不同液基制片技術(shù)和細胞學(xué)樣本的制作方法各異，且均有較多的人工操作步驟，導(dǎo)致制片效果的不穩(wěn)定，從而限制了液基制片技術(shù)在非婦科細胞學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。我科于2009年引進BDSurepath薄層液基制片技術(shù)(LCT制片)并用于非婦科細胞學(xué)樣本制作，通過不斷的摸索與改進，目前對于各種非婦科細胞學(xué)樣本均能制出較為滿意的液基細胞薄片。本文旨在分享我們的具體制片方法和經(jīng)驗，希望能促進液基制片技術(shù)在非婦科細胞學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，提高非婦科細胞學(xué)的診斷水平。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

主要儀器：AutoCytePREP全自動液基制片機等；主要試劑：紅色保存液(CyteRichRed)、蘇木素染液、EA/OG染液、TBS緩沖液(ph7.5～8.5)、消化液(化學(xué)名：巰基乙酸銨水溶液CAS5421-46-5)等。

1.2 操作步驟

1.2.1上機前處理

1.2.1.1取材與固定 (1)對于樣本量45mL及以上的液體類樣本，取45mL加入50mL離心管中，經(jīng)過一次離心傾出上清液，取細胞沉淀加入30mL紅色保存液中進行固定；(2)對于少于10mL的液體樣本以及痰、穿刺物等非液體類樣本，可直接加入30mL紅色保存液中，充分搖勻后室溫下靜置30min進行固定。

1.2.1.2離心 (1)靜置過的樣本，放入離心機以600g的轉(zhuǎn)速離心10min，倒掉上清液，加入10mLTBS緩沖液，充分搖勻并轉(zhuǎn)移至12mL離心管內(nèi)；(2)轉(zhuǎn)移后的樣本，放入離心機以600g的轉(zhuǎn)速再次離心5min，倒掉上清液并充分振蕩。

1.2.2上機染色 將經(jīng)過預(yù)處理的非婦科細胞學(xué)樣本，置于AutoCytePREP全自動液基制片機上，啟動PrepStain非婦科染色系統(tǒng)，并按照程序設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，進行全自動染色。

1.2.3透明和封片 (1)透明：上機染色完成后，取下載玻片置于盛有環(huán)保液(或二甲苯替代液)的染缸內(nèi)透明。分別過3次環(huán)保液透明劑(第1次2min，第2、3次各1min)進行透明；(2)中性樹膠封片。

2 結(jié) 果

細胞均勻分布在載玻片中央直徑13mm的圓形區(qū)內(nèi)，細胞團具有三維立體感，且保留了細胞原有的排列方式。相對于傳統(tǒng)涂片，細胞更集中、形態(tài)更清晰，可清楚地觀察到細胞質(zhì)和細胞核的細微結(jié)構(gòu)；薄片背景更干凈且保留了診斷所需的線索，如腫瘤素質(zhì)，炎性壞死等，利于非婦科細胞學(xué)的診斷(圖1、2)。

圖1 痰液中的腺癌細胞 (箭頭所示)，巴氏染色×400。

Figure 1. Adenocarcinoma Cells in Sputum (as indicated by the arrows);Papanicolaou Staining×400

a.Onlyasmallnumberofdegeneratedatypicalcellswerefoundonthetraditionalsmears.b.Manywell-formedtumorcellswerepresentedontheliquid-basedpreparationslide.

圖2 液基薄片中的腫瘤細胞保留了原有的排列方式

Figure2.TumorCellsontheLiquid-basedPreparationSlidesRetainedTheirOriginalArrangement

a. Adenoid cystic carcinoma; basal cell-like tumor cells arranged in strips or attached to the surface of characteristic mucous ball were found on the liquid-based preparation slide of bronchial brushing;papanicolaou staining×400. b. Small cell carcinoma; tumor cells with finely granular chromatin could be seen squeezing each other on the liquid-based preparation slide;papanicolaou staining×400.

3 討 論

非婦科液基學(xué)制片與傳統(tǒng)涂片比較具有背景更干凈、細胞更集中、分布更均勻、形態(tài)更清晰等優(yōu)勢，并可用于特殊染色和免疫細胞化學(xué)等輔助檢測，有利于提高非婦科細胞病理的診斷水平[2-6]。但也有文獻報道非婦科液基制片會出現(xiàn)細胞量減少，細胞退變或皺縮，腫瘤背景消失，成團的細胞失去原有的排列方式等不利于病理醫(yī)師觀察的現(xiàn)象[3，7-9]，有時還會出現(xiàn)薄片上細胞重疊，染色不佳或交叉污染等。根據(jù)我們多年的實踐和體會，如果選擇了合適的液基細胞制片技術(shù)，嚴格按照操作流程制片并在制片過程中注意了以下細節(jié)，均可以制備出滿意的薄片。

我們采用LCT離心沉降式制片技術(shù)進行制片。首先要重視各類樣本的取材和預(yù)處理：1)大于50mL的液體樣本在收到樣本后，需要靜置10min讓細胞沉淀，取材時倒掉上清液，盡量吸取容器底部的沉淀物，這樣有助于增加收集的細胞量。這一步非常重要，如果被忽略，則會導(dǎo)致細胞量減少； 2)第一次離心后，若沉淀物較多(如果50mL樣本的離心沉淀物超過5mL為量多)，僅需吸取少量(約1～2mL)的樣本裝入紅色保存液中；上機染色前應(yīng)在小離心管內(nèi)加入適量TBS緩沖液進行稀釋，并在沉降管內(nèi)加入3～5滴TBS緩沖液作為鋪墊，以減少細胞堆積重疊，并能防止上機染色時過多的細胞脫落造成交叉污染；另外，樣本每次離心后應(yīng)充分搖勻或振蕩，使離心管底部的沉淀物完全散開，使細胞能夠充分接觸紅色保存液和TBS緩沖液。離心后若有食物殘渣等雜質(zhì)以及體積較大的塊狀物可用紗布過濾； 3)對于血性成分較多的樣本，需在取材后滴加數(shù)滴冰醋酸搖勻(一般加3～5滴)，室溫下靜置10min后再離心。離心后可見樣本出現(xiàn)分層，上層為上清液，下層為血凝塊，用吸管取二者之間的灰白區(qū)樣本少許(約1～2mL)，加入紅色保存液中，再進行后續(xù)操作。冰醋酸有破壞紅細胞的作用，經(jīng)過處理后薄片上紅細胞明顯減少(圖3)。但冰醋酸會加深蘇木素的染色，因此不可過多滴加，以免影響染色效果； 4)痰液樣本在取材時盡量選取有血絲或灰白色顆粒部分。取材后除了加入紅色保存液外，還需滴加數(shù)滴消化液(約3～10滴)，并充分震蕩促使粘液溶解。如果粘液未能充分溶解，則可能導(dǎo)致細胞量減少。

圖3 血性胸水液基薄片

Figure 3.Liquid-based Preparation Slides of Bloody Pleural Fluid

a.Theslidewasbloodyifitwasnottreatedwithglacialaceticacid;papanicolaoustaining×100;b.Afterglacialaceticacidwasused,onlyafewredbloodcellswerefoundontheliquid-basedpreparationslide;thebackgroundwascleanerthanbefore;papanicolaoustaining×400.

其次要重視透明和封片：1)染色后需過3次環(huán)保液或二甲苯進行透明。每次制片前都需檢查環(huán)保液或二甲苯是否帶水，即需觀察試劑底部是否有水珠，若有水珠應(yīng)及時更換，以免影響脫水效果，以致鏡下觀呈水霧狀，細胞模糊不清，且容易掉色(圖4a)； 2)另一方面，紅色保存液雖能起到一定的固定作用，但并不能完全固定細胞的形態(tài)。一旦玻片暴露在空氣中則會發(fā)生干片，細胞會立即退變，鏡下觀細胞皺縮、細胞核深染，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)不清晰(圖4b)，不利于觀察。所以制片完畢后,應(yīng)將玻片迅速放置在100%乙醇或者透明劑內(nèi),整個制片過程包括封片均要確保濕片,可避免此現(xiàn)象發(fā)生。

若診斷需要，還可利用液基樣本進行特殊染色或免疫細胞化學(xué)檢測[10-11]。如果進行特殊染色，需先制作液基白片，然后將白片置于95%乙醇內(nèi)固定30min，再經(jīng)梯度酒精至水，接著按常規(guī)步驟進行特殊染色。在液基片上進行過碘酸希夫氏 (periodic acid Schiff，PAS)、阿新藍(Ashin blue，AB)、黏液卡紅、六氨銀和抗酸染色等均達到良好的效果，有助于病原體的識別，顯示與確定細胞內(nèi)外的正常結(jié)構(gòu)或病理過程中出現(xiàn)的異常物質(zhì)(圖5)。如需進行免疫細胞化學(xué)檢測，也要先制作液基白片，然后將白片置于4%多聚甲醛內(nèi)固定30min，再用蒸餾水清洗3次去除殘留的多聚甲醛，然后按常規(guī)免疫細胞化學(xué)的步驟進行檢測。結(jié)果顯示液基薄片上各種抗體陽性信號定位準確，背景干凈，有助于分析細胞類型和來源(圖6)。

圖4 腹水液基薄片

Figure 4.Liquid-based Preparation Slides of Peritoneal Fluid

a.Theslidewasfoggywithwater;papanicolaoustaining×200.b.Thecellswereobviouslyshringkingonthedriedslide,andthefinestructureofcellscouldnotbeclearlyobserved;papanicolaoustaining×200.

圖5 肺泡灌洗液液基薄片中的毛霉菌(箭頭所示)，PAS×400

Figure 5. Mucor on the Liquid-based Preparation Slide of Alveolar Lavage Fluid (as indicated by the arrow); PAS×400.

圖6 胸水液基薄片中轉(zhuǎn)移性肺腺癌細胞呈TTF-1核陽性，Envision×400

Figure 6. Metastatic Lung Adenocarcinoma Cells on the Liquid-based Preparation Slide were Positive for TTF-1 and the Positive Signals were Localized in the Nuclei; Envision×400.

高質(zhì)量的制片是病理診斷的基礎(chǔ)和保障，本文目的是通過分享四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科多年來積累的非婦科液基制片經(jīng)驗，以促進該技術(shù)的應(yīng)用，提升非婦科細胞學(xué)的診斷水平，讓更多的患者受益。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻檢測系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測；

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