乳腺癌組織中Livin和Smac的表達(dá)及其臨床意義*

徐聶，李昌林，肖敏偉，侯梅

乳腺癌目前全球發(fā)病率逐漸升高，但治療效果較好，其5年生存率已從1975年的30%增長(zhǎng)到2005年的90%[1-2]。目前學(xué)者多關(guān)注于乳腺癌的ER、PR、Her-2等基因的表達(dá)情況，但近年來研究凋亡相關(guān)基因在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用，有可能成為乳腺癌治療的新策略。

目前已發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存在抗凋亡基因和促凋亡基因。Livin是一種凋亡抑制蛋白，能抑制細(xì)胞凋亡，其組織分布也具有明顯的細(xì)胞選擇性，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，而在正常成人組織中無表達(dá)或低表達(dá)[3]。Smac(second mitochondria-derived activator of caspase)則是一種線粒體膜間隙蛋白；在細(xì)胞凋亡中，Smac通過解除凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)對(duì)半胱氨酸蛋白酶caspase的抑制而發(fā)揮促凋亡作用[4]。

目前，Livin與Smac在人乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況少見報(bào)道，本研究采用免疫組化S-P法檢測(cè)乳腺癌組織中Livin與Smac的表達(dá)情況，分析其臨床病理學(xué)意義和相互關(guān)系，為乳腺癌治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

試驗(yàn)組(乳腺癌組織)：收集華西醫(yī)院2004年1月～2004年12月手術(shù)切除的臨床各期乳腺癌患者石蠟標(biāo)本43例。

入組標(biāo)準(zhǔn)：1.接受乳腺癌根治性切除術(shù)(包含淋巴結(jié)清掃)，術(shù)后病理證實(shí)為乳腺癌(包括浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌)；手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到R0切除，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；2.術(shù)前均未進(jìn)行放化療及內(nèi)分泌治療；3.患者未伴發(fā)其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重創(chuàng)傷、炎癥感染、糖尿病及心血管合并癥。對(duì)照組(乳腺癌旁組織)：納入研究的乳腺癌患者對(duì)應(yīng)乳腺癌旁組織。 所有患者采用電話隨訪獲取隨訪信息，以手術(shù)日期為隨訪開始時(shí)間，2010年1月1日為隨訪截止時(shí)間。如乳腺癌5年內(nèi)復(fù)發(fā)視為終點(diǎn)事件，5年內(nèi)未復(fù)發(fā)視為截尾數(shù)據(jù)。

1.2 試劑

一抗兔抗人Livin多克隆抗體，工作濃度1 ∶100，購于美國(guó)Santa生物技術(shù)公司；一抗兔抗人Smac多克隆抗體，工作濃度1 ∶300，購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用S-P法，包括二甲苯脫蠟2次、3%過氧化氫避光處理以阻斷內(nèi)源性的過氧化氫酶、抗原熱修復(fù)處理；PBS液(磷酸鹽平衡生理鹽水)沖洗、滴加生物素標(biāo)記抗體稀釋，DAB染色液顯色，中性樹膠封片等步驟。

1.4 結(jié)果判定

Livin和Smac蛋白采用免疫組織化學(xué)S-P法，染色陽性表現(xiàn)為黃色或棕色顆粒，表達(dá)于細(xì)胞漿中。采用半定量積分法[5]，對(duì)每張切片的陽性細(xì)胞率及著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)記分。在400倍鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)Livin和Smac蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞所占百分率。陽性細(xì)胞率<5%記為0分，5%～25%記為1分，26%～50%記為2分，>50%記為3分；著色強(qiáng)度：基本不著色的記為0分，淡黃色的記為1分，棕黃色的記為2分，棕褐色的記為3分。每個(gè)視野染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞率所得分?jǐn)?shù)相乘為每個(gè)視野的得分，最后得分為5個(gè)視野分?jǐn)?shù)的平均值。0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，6分以上為強(qiáng)陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析處理，Livin與Smac蛋白在乳腺癌組織及乳腺癌旁組織之間的表達(dá)率情況，以及Livin和Smac的表達(dá)情況與不同臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；Livin與Smac在乳腺癌中表達(dá)的相關(guān)性用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)；患者生存情況用 Kaplan-Meier曲線方法進(jìn)行分析，無病生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本研究43例患者中年齡最小的為34歲，最大的為76歲，中位年齡55.4歲；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌31 例，非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌12例(導(dǎo)管內(nèi)癌8 例，粘液癌4例)；按照2002年AJCC乳腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期32例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)14例；受體三陰性患者13例，非三陰性患者30例；死亡5人，存活38人，5年生存率為88.4%。

2.1 Livin蛋白的表達(dá)情況

43例乳腺癌組織中Livin表達(dá)的陽性率79.1% (34/43) 明顯高于癌旁組織48.8% (21/43)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.524，P<0.01)(圖1)。

圖1 Livin和Smac蛋白在切片中的染色情況

Figure 1. Expression of Livin and Smac in Breast Cancer

A.ExpressionofLivininbreastcancertissue,theredarrowindicatesthepositiveexpressionofLivininthecytoplasmofcancercells(40×10);B.ExpressionofSmacinparacarcinomatissue,theredarrowindicatesthepositiveexpressionofLivininthecytoplasmofparacarcinomacells(40×10);C.NegativeexpressionofLivininparacarcinomatissue;D.NegativeexpressionofLivininbreastcancertissue.

進(jìn)一步分析Livin蛋白的表達(dá)與乳腺癌不同臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，采用χ2檢驗(yàn)，Livin的表達(dá)與乳腺癌的組織病理學(xué)類型、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、胸壁侵犯、受體情況及5年生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 Livin蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Table 1. Correlation between the Livin Expression and Clinicopathologic Features of Breast Cancer

VariableNLivin positive (n) -++++++Positive case(n)Positive rate(%)χ2PAge (year)0.0310.860 <551845811477.8 ≥5525512712080.0

(Table 1 continues on next page)

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VariableNLivin positive (n) -++++++Positive case(n)Positive rate(%)χ2PTumor size1.6400.200 ≤2cm1654701168.8 >2cm27413822385.2Pathological type4.3250.038 Invasive ductal carcinoma314151022787.1 Non-invasive ductal carcinoma125250758.3Chest wall invasion0.6480.421 Yes103340770.0 No336141122781.8TNM stage5.3720.020 Ⅰ～Ⅱ115321654.5 Ⅲ～Ⅳ324141312887.5Lymphnode metastasis6.0310.014 Yes293151012689.7 No146251857.1Receptor0.0520.820 Triple-negative1336221076.9 Non triple-negative306111302480.0Survival0.0030.957 ≤5 years51121480.0 >5 years388161313078.9

2.2 Smac蛋白的表達(dá)情況

Smac蛋白與Livin類似，也在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，43例乳腺癌組織中Smac表達(dá)的陽性率74.4%(32/43) 明顯低于癌旁組織93.0%(40/43)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.460，P<0.05)。

同樣，深入分析Smac蛋白的表達(dá)與乳腺癌不同臨床特征的之間的關(guān)系，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，Smac的表達(dá)與乳腺癌的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、病理學(xué)類型、浸潤(rùn)深度、受體情況及5年生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 Smac蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Table 2. Correlation between the Smac Expression and Clinicopathologic Features of Breast Cancer

VariableNSmac positive (n) -++++++Positive case(n)Positive rate(%)χ2PAge (year)0.0780.779 <551857601372.2 ≥5525615131976.0Tumor size0.6250.429 ≤2cm1636521381.3 >2cm27816211970.4Pathological type0.5250.469 Invasive ductal carcinoma31720222477.4 Non-invasive ductal carcinoma124251866.7Chest wall invasion0.2310.644 Yes102440880.0 No33918332472.7TNM stage11.2440.001 Ⅰ～Ⅱ117031436.4 Ⅲ～Ⅳ32422422887.5

(Table 2 continues on next page)

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VariableNSmac positive (n) -++++++Positive case(n)Positive rate(%)χ2PLymphnode metastasis4.3290.037 Yes281010511664.3 No15112221493.3Receptor0.0610.804 Triple-negative1335321076.9 Non triple-negative30817412273.3Survival0.6180.432 ≤5 years52120360.0 >5 years38921532976.3

2.3 Livin及Smac蛋白表達(dá)的相互關(guān)系

采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，分析乳腺癌中Livin及Smac的陽性表達(dá)情況(見表3)，發(fā)現(xiàn)兩者之間呈負(fù)相關(guān)，r=-0.302,P<0.05。

表3 乳腺癌組織中Livin和Smac表達(dá)的相關(guān)性

Table 3. Correlation between Livin and Smac Expression in Breast Cancer

VariableLivinSmac-++++++-0290+21131++7140+++0111r-0.302P0.049

2.4 生存分析

43例患者均采用電話隨訪獲取隨訪信息，以手術(shù)日期為隨訪開始時(shí)間，無失訪病例，所有患者隨訪時(shí)間均≥60個(gè)月。隨訪截止時(shí)間為2010年1月1日；其中29例5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。無病生存期指從手術(shù)后的第一天開始至第一次復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間。Livin蛋白陰性組中有3例出現(xiàn)復(fù)發(fā)，5年無病生存率為66.7%；陽性組中有26例出現(xiàn)復(fù)發(fā)，5年無病生存率為23.5%，經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，Livin陰性表達(dá)組比陽性表達(dá)組術(shù)后5年無病生存率高，進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.527，P<0.05)(圖2)。而Smac陰性組中有6例出現(xiàn)復(fù)發(fā)，5年無病生存率為58.2%；陽性組中有23例出現(xiàn)復(fù)發(fā)，無病生存率為28.1%，經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，Smac陰性表達(dá)組與陽性表達(dá)組之間術(shù)后5年無病生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.529，P>0.05)(見圖2)。

圖2 Livin與Smac蛋白表達(dá)差異者的Kaplan-Meier生存曲線

Figure 2. Kaplan-Meier Survival Curve of Patients with Different Livin and Smac Expressions

A.Livinexpressionbetweenthenegativegroupandthepositivegroup;B.Smacexpressionbetweenthenegativegroupandthepositivegroup.

3 討 論

細(xì)胞凋亡是目前細(xì)胞死亡研究的熱門領(lǐng)域。當(dāng)?shù)蛲稣{(diào)控失衡時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生[6]。抑凋亡基因IAPs家族具有明顯的抗細(xì)胞凋亡能力，近年來引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[7]。眾所周知，IAP蛋白過表達(dá)能使腫瘤細(xì)胞積聚，并增加腫瘤的耐藥性[8]。IAPs家族由8種蛋白所組成，其中Livin是目前抗凋亡活性最強(qiáng)的一種，最初是從黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如膀胱癌、肺癌、肝癌、胃癌、淋巴瘤等[9-15]。本研究中癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織(P<0.05)，由此推測(cè)Livin可能通過抑制乳腺細(xì)胞的正常凋亡而在乳腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

根據(jù)表1中可發(fā)現(xiàn)，Livin的表達(dá)與患者的病理類型、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、腫瘤大小、胸壁侵犯、受體情況、5年生存期均無關(guān)(P>0.05)。分層分析顯示：Livin的表達(dá)水平隨著乳腺癌臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加而增高；腫瘤體積越大、分期越晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Livin陽性表達(dá)例數(shù)增多，這與趙秋民[16]的報(bào)道一致。同時(shí)還分析發(fā)現(xiàn)，Livin在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)率明顯高于非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，這種與病理類型相關(guān)的Livin表達(dá)差異尚待進(jìn)一步研究。

Smac是被Du等[17]從 HeLa細(xì)胞中分離出的一種蛋白，由線粒體膜間隙釋放, 又稱為第二個(gè)線粒體來源的胱天蛋白酶激活劑。它能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與IAPS家族蛋白相互作用[18]。本研究中Smac在癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織(P<0.05)；而且表達(dá)的陽性例數(shù)在癌組織中隨表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)而逐漸降低(表達(dá)強(qiáng)度+>++>+++)，在癌旁組織中卻逐漸升高。目前，Smac相關(guān)制劑已用于實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，以檢測(cè)藥物的安全性、藥代動(dòng)力學(xué)、最大耐受劑量及初步療效[19]。另外，本研究中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Smac蛋白表達(dá)下降，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與患者的年齡、腫瘤大小、病理學(xué)類型、胸壁侵犯、受體情況、5年生存期無關(guān)(P>0.05)，說明Smac表達(dá)降低或缺失可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

抑凋亡蛋白Livin和促凋亡蛋白Smac之間有可能存在著某種關(guān)聯(lián)。正常組織和細(xì)胞中，兩者的動(dòng)態(tài)平衡維持著正常的生理代謝，在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。兩者的相互調(diào)節(jié)過程涉及到多種因子的參與，深入研究二者在乳腺癌中的關(guān)系、作用及其機(jī)制，將為乳腺癌的治療提供新思路。本研究使用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Livin和Smac蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，即乳腺癌中l(wèi)ivin蛋白表達(dá)上調(diào)，Smac蛋白表達(dá)下降，而且兩者的表達(dá)均與乳腺癌的臨床病理特征和生物學(xué)行為密切相關(guān)，推測(cè)兩者共同參與腫瘤的調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤快速增長(zhǎng)。

本研究對(duì)43例乳腺癌患者進(jìn)行了隨訪，經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，Livin陰性表達(dá)組比陽性表達(dá)組術(shù)后5年無病生存率高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Livin的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞過度繁殖，患者可能預(yù)后不良，有可能成為評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)。而Smac陰性表達(dá)組與陽性表達(dá)組之間術(shù)后5年無病生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，繼續(xù)深入研究?jī)烧咴谌橄侔┲械年P(guān)系及機(jī)制，或許具有重要的臨床意義。

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