Matrigel三維培養(yǎng)模型對(duì)乳腺癌細(xì)胞整合素β1的定位及胞外基質(zhì)粘附的影響*

辜翠容，劉惠芬，王浩，黃靈瀟，黃建鳴，米坤

隨著對(duì)腫瘤微環(huán)境的認(rèn)識(shí)深入，越來(lái)越多的研究表明腫瘤惡性進(jìn)展與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)[1-4]，整合素也參與其中[5-7]。整合素是一類(lèi)關(guān)鍵分子，可介導(dǎo)細(xì)胞與ECM間的連接，使細(xì)胞在基因表達(dá)及行為等多方面發(fā)生改變。采用接近體內(nèi)微環(huán)境的培養(yǎng)模型對(duì)腫瘤微環(huán)境研究非常重要。Matrigel 3D培養(yǎng)模型已經(jīng)廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究的諸多領(lǐng)域[8-9]。3D培養(yǎng)模型既能較好地模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)及空間結(jié)構(gòu), 又具備細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性和可控性，細(xì)胞的基因表達(dá)模式及其生命活動(dòng)更接近于生命有機(jī)體[10]。研究顯示整合素β1在細(xì)胞表面的重新分布與腫瘤細(xì)胞之間粘附能力的改變，并與侵襲遷移過(guò)程中腫瘤細(xì)胞粘附ECM能力的變化密切相關(guān)[11-12]。當(dāng)整合素β1與不同的α整合素亞基配對(duì)結(jié)合構(gòu)成整合素分子時(shí)，可與其配體層粘連蛋白、纖連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白等結(jié)合，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能及腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[13-16]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究2D及Matrigel 3D培養(yǎng)模型中乳腺癌細(xì)胞表面整合素β1的定位及其介導(dǎo)的細(xì)胞與ECM蛋白的粘附能力，揭示乳腺癌細(xì)胞在模擬體內(nèi)3D微環(huán)境的情況下與胞外微環(huán)境的相互作用，為研究乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

本研究所用的細(xì)胞系為人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435S及MDA-MB-231，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、0.25% Trypsin-EDTA購(gòu)自Invitrogen公司；Matrigel、超純層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、纖連蛋白購(gòu)自BD Biosciences公司；整合素β1抗體購(gòu)自Cell signaling公司；DAPI及鈣黃綠素(Calcein AM)購(gòu)自Molecular Probes公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 2D細(xì)胞培養(yǎng) 完全培養(yǎng)基使用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞接種后置于37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 至80%～90%融合度時(shí)胰酶消化傳代。

1.2.2 3D細(xì)胞培養(yǎng) 4℃溶解Matrigel母液。消化細(xì)胞，重懸至完全培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)終濃度為5×105/mL。使用時(shí)置于冰上，用預(yù)冷的細(xì)胞重懸液與Matrigel等體積混勻，24孔板中每孔加入100μL。37℃放置30min使其成膠，添加完全培養(yǎng)液。置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，第二日換液后隔日換液一次。

1.3 細(xì)胞存活力的檢測(cè)

采用鈣黃綠素Calcein AM檢測(cè)細(xì)胞胞內(nèi)普遍存在的酯酶活性來(lái)分析細(xì)胞存活力。預(yù)冷PBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，每次15min，以去除或稀釋血清中的酯酶活性。將2μM的Calcein AM工作液添加至3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中，室溫孵育45min。倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.4 免疫熒光染色

細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定后PBS洗滌，加入blocking 溶液，室溫下孵育2h。IF buffer稀釋整合素β1一抗溶液加入細(xì)胞中4℃孵育過(guò)夜。IF buffer室溫下洗滌3次后加入二抗工作液孵育60min。PBS洗滌后添加300nM的DAPI工作液，室溫下孵育5min。PBS洗滌3次后熒光顯微鏡下觀察并采圖。

1.5 細(xì)胞粘附率的研究

96孔板每孔中分別添加50μg/mL的纖粘蛋白，層粘連蛋白和IV型膠原，室溫下干燥。收集100～150 個(gè)2D培養(yǎng)細(xì)胞及3D細(xì)胞克隆于100μL無(wú)血清的培養(yǎng)基中，添加至孔板后37°C孵育4小時(shí)。各孔細(xì)胞總數(shù)在顯微鏡下計(jì)數(shù)，隨后用PBS洗滌3次以去除未粘附的細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞，計(jì)算粘附率[17]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用標(biāo)準(zhǔn)差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)在三維Matrigel基質(zhì)中的乳腺癌細(xì)胞形貌結(jié)果

圖1為乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S及MDA-MB-231生長(zhǎng)在3D Matrigel基質(zhì)中的明場(chǎng)圖。在3D Matrigel基質(zhì)中的細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)出球形的克隆，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞克隆逐漸增大。通過(guò)培養(yǎng)3天、 5天及7天后的形貌圖可明顯分辨，在Matrigel中，MDA-MB-435S細(xì)胞逐漸形成了多細(xì)胞的球形細(xì)胞克隆，MDA-MB-231細(xì)胞在培養(yǎng)7天后細(xì)胞克隆之間形成觸手狀連接，提示3D培養(yǎng)的建立使得乳腺癌細(xì)胞在胞外基質(zhì)微環(huán)境中形成了具有3D空間結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞群。

2.2 3D Matrigel培養(yǎng)模型中細(xì)胞的活性分析

活細(xì)胞內(nèi)的酯酶可將無(wú)熒光的Calcein AM 轉(zhuǎn)化為強(qiáng)綠色熒光的Calcein。從圖2中可以看出，細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)中的存活力好，細(xì)胞與Matrigel材料具有較好的生物相容性，3D Matrigel培養(yǎng)模型可模擬腫瘤細(xì)胞外微環(huán)境用于后續(xù)研究。

圖1 乳腺癌MDA-MB-435S和MDA-MB-231細(xì)胞在3D Matrigel中培養(yǎng)3、5、7日時(shí)的明場(chǎng)圖

Figure 1. MDA-MB-435S and MDA-MB-231 Cultured in 3D Matrigel at the Third, Fifth and Seventh Day Respectively

圖2 MDA-MB-435S和MDA-MB-231細(xì)胞在3D Matrigel中的細(xì)胞存活熒光圖(bar=500μm)

Figure 2. Encapsulation of Cells in 3D Matrigel Using Calcein-AM Staining for the Living Cells(bar=500μm)

2.3 生長(zhǎng)在3D Matrigel基質(zhì)中的乳腺癌細(xì)胞整合素β1的表達(dá)定位結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對(duì)Matrigel 3D培養(yǎng)模型中5d時(shí)期形成的細(xì)胞球形克隆進(jìn)行整合素β1的免疫熒光檢測(cè)，分析其在細(xì)胞克隆中的表達(dá)定位。培養(yǎng)在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)瓶的細(xì)胞并不能展現(xiàn)體內(nèi)3D空間中細(xì)胞的整合素表達(dá)，而是在2D模式下，平鋪的細(xì)胞膜表面彌散性地表達(dá)整合素β1(圖3)，無(wú)法呈現(xiàn)3D空間結(jié)構(gòu)下的細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。整合素β1在體內(nèi)正常上皮細(xì)胞的基底外側(cè)表面特異性地表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞中錯(cuò)誤定位并且表達(dá)增高[18]。我們?cè)谌橄侔┘?xì)胞的3D Matrigel培養(yǎng)模型中觀察到，多細(xì)胞克隆中整合素β1高表達(dá)于細(xì)胞與細(xì)胞之間，細(xì)胞與微環(huán)境的ECM之間(圖4)，與2D培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的伸展形式細(xì)胞上整合素β1的分布(圖3)形成顯著差異，這使其可介導(dǎo)并穩(wěn)定細(xì)胞與ECM間的連接，進(jìn)而作為ECM的受體，在細(xì)胞粘附發(fā)生時(shí)激活胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起細(xì)胞在基因表達(dá)及行為等多方面發(fā)生效應(yīng)。

圖3 2D培養(yǎng)模式下MDA-MB-435S和MDA-MB-231細(xì)胞中整合素β1(綠色)及細(xì)胞核(藍(lán)色)的免疫熒光圖(bar=50μm)

Figure 3. Immunofluorescence Characterization of Integrin β1 (Green) with DAPI Stained Nuclear (Blue) in Cells in 2D Culture Model(bar=50μm)

圖4 3D Matrigel培養(yǎng)模式下MDA-MB-435S和MDA-MB-231細(xì)胞中整合素β1(綠色)及細(xì)胞核(藍(lán)色)的免疫熒光圖(bar=50μm)

Figure 4. Immunofluorescence Characterization of Integrin β1 (Green) with DAPI Stained Nuclear (Blue) in Cells in 3D Matrigel Culture Model(bar=50μm)

2.4 細(xì)胞對(duì)ECM蛋白的粘附率結(jié)果

MDA-MB-435S和MDA-MB-231細(xì)胞于2D培養(yǎng)及3D Matrigel基質(zhì)中培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞克隆對(duì)不同的ECM蛋白包括層粘連蛋白(laminin)，纖粘蛋白(fibronectin)及IV型膠原(collagen IV)的粘附率出現(xiàn)顯著性差異，結(jié)果如圖5所示。與2D細(xì)胞相比較，3D培養(yǎng)的細(xì)胞克隆對(duì)層粘連蛋白的粘附率明顯下降，而對(duì)纖粘蛋白和IV型膠原的粘附率均呈現(xiàn)上升，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(P<0.05)。粘附率的差異結(jié)果表明，在2D及3D的不同培養(yǎng)條件下，細(xì)胞與ECM的相互作用存在顯著性差異，這與3D培養(yǎng)基質(zhì)微環(huán)境中乳腺癌細(xì)胞整合素β1的表達(dá)及其定位直接相關(guān)，也是腫瘤微環(huán)境影響細(xì)胞行為的又一有力證明。

圖5 2D與3D不同培養(yǎng)模式下MDA-MB-435S和MDA-MB-231細(xì)胞與ECM蛋白的粘附率結(jié)果(P<0.05)

Figure 5. Adhesion Ability of of MDA-MB-435S and MDA-MB-231 to ECM Proteins in 2D and 3D Culture Models(P<0.05)

3 討 論

細(xì)胞在2D環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)有若干重大的缺點(diǎn)[19]：第一，2D 培養(yǎng)無(wú)法建立一個(gè)真正的化學(xué)信號(hào)的3D 梯度；第二，從有機(jī)體直接分離下來(lái)的細(xì)胞在 2D 培養(yǎng)中會(huì)頻繁地改變新陳代謝及基因的表達(dá)模式；第三，細(xì)胞在 2D 環(huán)境中生長(zhǎng)可顯著改變ECM蛋白的表達(dá)并導(dǎo)致形態(tài)學(xué)的變化，細(xì)胞表面的受體如整合素等不能正確地聚集定位，影響了細(xì)胞間的交流。體內(nèi)微環(huán)境是一個(gè)立體的3D組織微環(huán)境，細(xì)胞對(duì)微環(huán)境的應(yīng)答方式對(duì)細(xì)胞行為具有關(guān)鍵指導(dǎo)作用，涉及細(xì)胞與細(xì)胞之間，細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的一系列復(fù)雜的相互作用。3D細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果揭示，生長(zhǎng)在3D環(huán)境中的細(xì)胞，其基因表達(dá)模式和一系列生物學(xué)活動(dòng)更接近生命有機(jī)體。腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細(xì)胞本身，細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞因子等，體外構(gòu)建腫瘤微環(huán)境需選擇合適的細(xì)胞外基質(zhì)。許多研究中使用的3D培養(yǎng)支架為帶有微米級(jí)孔隙的合成聚合物，如直徑為微米級(jí)別的聚乳酸/羥基乙酸共聚物等形成的支架材料等。而類(lèi)似于生物組織的納米孔隙結(jié)構(gòu)才是真正接近于體內(nèi)環(huán)境的材料，包括Ⅰ型鼠尾膠原和Matrigel基質(zhì)等水凝膠類(lèi)基質(zhì)已被諸多研究者用作3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。Matrigel是從EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性基底膜抽提物, 可在室溫下成水凝膠并形成重組基膜，是理想的腫瘤細(xì)胞3D基質(zhì)培養(yǎng)材料之一，我們的實(shí)驗(yàn)選擇了Matrigel基質(zhì)構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞3D培養(yǎng)模型，在Matrigel水凝膠基質(zhì)中細(xì)胞成3D生長(zhǎng)方式，形成更接近體內(nèi)腫瘤組織的3D結(jié)構(gòu)，可用于研究整合素β1的定位及胞外基質(zhì)粘附的影響，并可在腫瘤發(fā)生發(fā)展、信號(hào)通路及藥物篩選等進(jìn)行下一步深入的研究。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境的一系列相互作用的結(jié)果。腫瘤微環(huán)境的成分及功能大部分尚不明確，但ECM與其密切相關(guān)。ECM是由膠原蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白、玻璃粘連蛋白、蛋白多糖、透明質(zhì)烷及硫酸類(lèi)肝素蛋白多糖構(gòu)成的細(xì)胞外環(huán)境。ECM在發(fā)展模式，組織構(gòu)建以及細(xì)胞微環(huán)境上發(fā)揮了關(guān)鍵性的角色。在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞與ECM發(fā)生粘附并附著是轉(zhuǎn)移的第一步，整合素β1可通過(guò)與ECM蛋白如層粘連蛋白，纖粘蛋白及IV型膠原等結(jié)合，提高腫瘤細(xì)胞的遷移能力[20]。最新研究證實(shí)整合素β1也是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及藥物耐受的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子[21-22]，可作為重要的生物標(biāo)記用于三陰乳腺癌的診斷中[23]。整合素β1作為一種重要的細(xì)胞粘附分子受體，在更接近于體內(nèi)微環(huán)境的3D模型中對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究已成為突破點(diǎn)之一。目前，3D模型研究腫瘤微環(huán)境與整合素β1，及其與侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系在國(guó)內(nèi)外均處于起步階段。本研究首次在腫瘤細(xì)胞3D模型中將整合素β1的表達(dá)定位與ECM蛋白的相關(guān)性進(jìn)行研究，旨在探討模擬體內(nèi)微環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)模式下，乳腺癌細(xì)胞整合素β1與胞外微環(huán)境的聯(lián)系，為腫瘤細(xì)胞學(xué)研究提供一種新的研究模式與方法。腫瘤微環(huán)境與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中微環(huán)境ECM與腫瘤細(xì)胞的相互作用有待進(jìn)一步明確。通過(guò)胞外微環(huán)境與整合素β1的相關(guān)研究將有助于對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)有進(jìn)一步的理解，對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥性及信號(hào)通路的研究乃至腫瘤的治療起到相應(yīng)的指導(dǎo)作用。

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