毛殼菌來源的α-葡聚糖酶酶學性質(zhì)分析及制糖生產(chǎn)輔料對其活性影響

黎志德，梁達奉*，張九花，黃曾慰，李雨虹

(1廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2廣東省酶制劑與生物催化工程技術研究中心，廣東廣州510316)

0 前言

α-葡聚糖酶是一種特異性水解葡聚糖 α-1,6糖苷鍵的酶。酶促反應終產(chǎn)物包括異麥芽寡糖和少量低聚合度的葡聚糖[1]。在制糖生產(chǎn)中，甘蔗或者甜菜在砍收運輸堆放過程中易發(fā)生微生物感染并產(chǎn)生葡聚糖，而葡聚糖的出現(xiàn)會對后續(xù)生產(chǎn)產(chǎn)生一系列不良影響[2]。傳統(tǒng)蔗汁澄清工藝對多糖類物質(zhì)的清除效率并不高[3]，而 α-葡聚糖酶可以有效應對這一問題。目前α-葡聚糖酶在甘蔗亞硫酸法生產(chǎn)耕地白糖[4]、原糖精煉[5]以及甜菜制糖方面均有應用試驗報道。此前國內(nèi)有報道指出，已對朱黃青霉來源的α-葡聚糖酶基因片段進行克隆[6]并在酵母上表達[7]，以及對其發(fā)酵產(chǎn)物進行進一步純化和酶學性質(zhì)分析的研究[8]。此后針對制糖生產(chǎn)的實際條件，在適應已有設備和工藝參數(shù)的前提下，對原有的酶制劑提出了更高的要求。本文在此前研究不同基因來源的α-葡聚糖酶基本酶學性質(zhì)表征的基礎上，研究甘蔗制糖生產(chǎn)中常見輔料對其活性的影響，為在實際生產(chǎn)調(diào)控時提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

α-葡聚糖酶凍干粉，聚丙烯酰胺 T1150：廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)；α-葡聚糖：美國SIGMA公司；3,5-二硝基水楊酸：國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸，磷酸氫二鈉，磷酸，無水亞硫酸鈉，氯化鈣，氫氧化鈉，苯酚，酒石酸鉀鈉：廣州化學試劑廠(均為分析純)。

DK-S24恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；U2800紫外-可見分光光度計，美國Unico公司；FiveEasyTMFE20 pH計電子分析天平，美國梅特勒公司。

α-葡聚糖酶基因序列來源于Chaetomium，廣州市微生物所冷凍干燥。

1.2 實驗方法

1.2.1 毛殼菌屬來源α-葡聚糖酶的酶學性質(zhì)

1.2.1.1 不同底物分子量對 α-葡聚糖酶反應速率的影響

選取型號 D9260、31387、09184、31392 和 D5376的 α-葡聚糖粉末，其相對分子量分別為 9000～11000、15000～25000、100000、450000～650000、1500000～2800000 g/mol。按質(zhì)量體積比2.0%加入到檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5.5)中，攪拌使之充分溶解，再加入經(jīng)適當稀釋的酶液，測定酶活。以分子量最高的 D5376的測定值為 100%，其余折算成相對酶活。

1.2.1.2 α-葡聚糖酶的最適反應溫度

選取pH 5.5，含有2.0% α-葡聚糖D5376的反應底物溶液，加入經(jīng)適當稀釋的酶液，分別在35、45、55、65、75℃下反應10 min，測定酶活，以最高活性的樣本為100%，其余折算成相對值。

1.2.1.3 α-葡聚糖酶的最適反應pH

配制0.2 mol/L Na2HPO4溶液，0.1 mol/L檸檬酸溶液作為母液，再分別配制pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，再按2.0%(m/V)比例加入α-葡聚糖D5376，充分溶解后備用。將經(jīng)適當稀釋的酶液加入到上述底物溶液中，測定酶活。以活性最高的樣本為100%，其余折算成相對值。

1.2.1.4 α-葡聚糖酶的最適底物濃度

取 pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%(m/V)比例加入α-葡聚糖D5376，充分溶解后備用。將經(jīng)適當稀釋的酶液加入到上述底物溶液中，測定酶活，以底物濃度2.0%(m/V)的樣本為100%，其余折算成相對值。

1.2.1.5 反應時間對α-葡聚糖酶酶活測定的影響

將 α-葡聚糖酶液稀釋至適當倍數(shù)，加入到2.0%(m/V)底物溶液中，55℃水浴，分別測定反應時間為 5、10、15、30、45、60、90 min時的酶活，以反應時間為10 min的樣本為100%，其他折算成相對酶活。

1.2.2 制糖生產(chǎn)中加入的輔料對α-葡聚糖酶的影響

1.2.2.1 SO32-濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

據(jù)文獻數(shù)據(jù)[9]，制糖工藝中12 mL的硫熏強度相當于向每100 mL溶液里加入2.0 mL濃度為6.0%的H2SO3?，F(xiàn)將硫熏強度梯度定為0、9、15、21、30 mL，將最高值樣本所含的 SO2折算成等摩爾的Na2SO3，即每100 mL溶液含有0.046 g Na2SO3。取pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，分別加入對應量Na2SO3，再調(diào)整pH到5.5。最后加入2.0%的α-葡聚糖 D5376充分溶解后備用。加入 Na2SO3的底物溶液與空白底物溶液分別配制成對應硫熏強度的底物溶液，加入經(jīng)適當稀釋的酶液，各組獨立空白對照，測定酶活。以空白樣本為100%對照，折算成相對酶活。

1.2.2.2 Ca2+濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

文獻[10]指出，CaO(生石灰)加入到蔗汁后會與蔗糖形成糖化鈣。實際生產(chǎn)時，是按0.1%～1.0%的比例將CaO加入到約13%濃度的蔗糖溶液中?，F(xiàn)假定鈣是完全電離，經(jīng)折算后選定Ca2+濃度0.05 mol/L作為最高值。取 pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，加入CaCl2至0.05 mol/L，待充分溶解后再次將pH調(diào)整到 5.5，最后加入 2.0%的 α-葡聚糖 D5376配置成底物溶液。與不含Ca2+的一般底物溶液勾兌成含不同濃度Ca2+的底物溶液，加入經(jīng)適當稀釋的酶液，各組獨立空白對照，測定酶活。以不含Ca2+的樣本為100%對照，其余折算成相對酶活。

1.2.2.3 P2O5濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

甘蔗制糖生產(chǎn)中一般以P2O5來衡量磷酸值，在澄清工段中，蔗汁中 P2O5的殘余總量一般不超過500 mg/L[10]。因此選擇分析樣本的P2O5濃度分別為100、200、300、400、500 mg/L。實驗中以相同摩爾數(shù)的Na2HPO4代替H3PO4，取 pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，加入對應量的Na2HPO4，然后將pH調(diào)整到5.5，再加入2.0%的α-葡聚糖D5376，充分溶解后備用。加入經(jīng)適當稀釋的酶液，各留一組空白對照，55℃下測定酶活。以不含P2O5的樣本為100%，其余折算成相對酶活。

1.2.2.4 聚丙烯酰胺對α-葡聚糖酶活性的影響

取聚丙烯酰胺(PAM)T1150顆粒充分溶解在pH 5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，PAM濃度為0.1%。加入2.0%的α-葡聚糖D5376攪拌使其充分溶解，與空白底物溶液勾兌成不同聚丙烯酰胺濃度。然后各組獨立空白對照，測定酶活，各組獨立空白對照。以空白樣本為100%，其余折算成相對酶活。

1.2.3 主要參數(shù)的計算方法

酶活測定按照 3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[11]，用外標法得到葡萄糖標準曲線：

葡萄糖含量(mg/mL)=A×OD540nm+b。

將 0.1 mL稀釋至適當倍數(shù)的 α-葡聚糖酶液加入到0.9 mL的底物溶液當中，水浴反應10 min，加入2.0 mL DNS至溶液中反應，沸水浴5 min，定容至20 mL。

測定反應體系的 OD540nm值，按以下公式進行計算：

酶活(U/mL)=(OD540nm-b)/A×稀釋倍數(shù)×1000/180。

反應以滅活酶液作為空白校準，每次反應前，先將預處理好的酶液進行酶活測定。以起始樣本測定所得酶活為100%，然后按百分比折算各個反應后樣本的值為剩余酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛殼菌來源α-葡聚糖酶的酶學性質(zhì)

2.1.1 底物分子量對α-葡聚糖酶的反應速率的影響

從表1可以觀察到α-葡聚糖酶的酶促反應效率受底物的分子量影響。當 α-葡聚糖的分子量小于100000 g/mol時，分子量較高的底物樣本單位時間內(nèi)產(chǎn)生還原端更多，折算后的α-葡聚糖酶活性更高。在分子量大于100000 g/mol區(qū)間的數(shù)據(jù)，經(jīng)方差分析P=0.085＞0.05，即樣本間差異并不顯著。根據(jù)底物分子量減少時酶促反應受分子量的變化趨勢判斷，用高分子量型號的α-葡聚糖可以使酶活測定受底物降解程度影響更少，數(shù)據(jù)更穩(wěn)定。

表1 不同底物分子量對α-葡聚糖酶的反應速率的影響

2.1.2 α-葡聚糖酶的最適反應溫度

圖 1實驗結(jié)果表明，α-葡聚糖酶在 55℃到 60℃的區(qū)間內(nèi)酶促反應活性最高且保持平穩(wěn)。當反應溫度下降到45℃或者上升到65℃時，酶的反應速率會下降約一半。溫度進一步偏離時，酶活進一步降低，且高溫區(qū)間下降速度比低溫區(qū)間要大。考慮到甘蔗制糖生產(chǎn)時壓榨工段有較長的停留期以及相對合適的環(huán)境溫度，還有在高濃度蔗糖條件下，酶的熱穩(wěn)定性也會有明顯的增長，α-葡聚糖酶具有在多個工藝位點加入的潛力。

2.1.3 α-葡聚糖酶的最適反應pH

圖 2實驗結(jié)果表明，α-葡聚糖酶具有較好的酸堿度適應性，酶促反應活力最高點在pH 5.5上，而且在pH 4.0～7.0的區(qū)間內(nèi)都有較高的活性，而此范圍與鮮榨蔗汁的常見 pH重合。但是當反應環(huán)境的pH值低于4.0或者高于pH 7.0時，酶活會大幅度降低。

2.1.4 α-葡聚糖酶的最適底物濃度

圖3實驗結(jié)果表明，當?shù)孜铴?葡聚糖D5376在緩沖溶液中的濃度達到2.0%(w/V)后，α-葡聚糖酶酶活變化趨于平穩(wěn)，說明酶與底物的結(jié)合位點已經(jīng)趨于飽和狀態(tài)，同時高分子量的葡聚糖會提高溶液粘度，不利于反應底物與產(chǎn)物的擴散，反而影響酶促反應的整體效率?？梢娫诖_定α-葡聚糖酶添加量時，應該綜合考慮葡聚糖含量，物料或樣本的成分與性狀，反應溫度等因素。

圖1 α-葡聚糖酶的最適反應溫度

圖2 α-葡聚糖酶的最適反應pH

圖3 α-葡聚糖酶的最適底物濃度

2.1.5 反應時間對α-葡聚糖酶酶活測定的影響

從圖4中可以觀察到，取樣時間越短測量折算后的酶活就越高，取樣時間5 min時折算的酶活比10 min高20%，而90 min則下降60%。此現(xiàn)象說明α-葡聚糖酶活性隨著反應時間的延長逐漸衰減。綜合各點數(shù)據(jù)，在pH 5.5和55℃的條件下持續(xù)反應1 h，α-葡聚糖酶仍能保持一半以上的相對酶活。因此在實際使用時，若酶加入后有較長的停留時間，可以適當減少其用量。

圖4 不同時間取樣測得的α-葡聚糖酶活性

2.2 制糖生產(chǎn)中加入的輔料對α-葡聚糖酶的影響

2.2.1 SO2濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

圖5實驗結(jié)果表明，溶液中SO32-濃度的增加，對α-葡聚糖酶活性的影響并不明顯。與空白對照相比，硫熏強度為9 mL的樣本酶活下降約5.3%，SO32-濃度為30 mL樣本的酶活下降幅度約14.5%，說明保持反應環(huán)境pH穩(wěn)定，單一SO32-對酶的影響比較輕微。

圖5 不同SO2濃度下測得的α-葡聚糖酶活性

2.2.2 Ca2+濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

從圖6中可以觀察到，在控制溶液pH的前提下，酶活隨著Ca2+濃度的上升而逐漸降低，但幅度并不大。當Ca2+濃度在最高組的0.05 mg/mL時，酶活的下降幅度也僅為 13.4%。甘蔗制糖生產(chǎn)中，加入生石灰的主要目的是生成亞硫酸鈣絮狀物和調(diào)節(jié)pH。由于產(chǎn)生大量游離鈣離子的時間很短，對酶產(chǎn)生的實際影響還會進一步減弱。

2.2.3 P2O5濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

從圖7中可見，在加入的P2O5濃度上升至500 mg/L的過程中，酶活變化范圍沒有超過 5.3%，可見加入該濃度范圍內(nèi)的P2O5對α-葡聚糖酶活性的影響并不明顯。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，如果直接加入H3PO4后重新調(diào)整pH到5.5，底物會發(fā)生明顯的自然降解，放置時間過程會明顯降低酶活的測定值。

2.2.4 聚丙烯酰胺濃度對α-葡聚糖酶活性的影響

圖6 不同Ca2+濃度下測得的α-葡聚糖酶的活性

圖7 不同P2O5濃度下測得的α-葡聚糖酶的活性

圖8 實驗結(jié)果表明，聚丙烯酰胺對α-葡聚糖酶的活性影響并不大，不同濃度樣本的酶活衰減程度最大不超過 12.1%。同時，底物溶液的粘度隨著聚丙烯酰胺濃度的上升而明顯加大。

圖8 不同PAM濃度下測得的α-葡聚糖酶的活性

3 結(jié)論與討論

經(jīng)上述研究表明，α-葡聚糖酶的最適反應條件是60℃，pH 5.5，底物濃度為2.0%。制糖生產(chǎn)常見的SO32-，Ca2+，P2O5和聚丙烯酰胺對酶活影響并不明顯。在實驗中，直接加入H3PO4模擬磷酸值影響測定數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和準確性，考慮到慣用的緩沖液體系也含有一定濃度的磷酸鹽，這一問題有待進一步實驗研究。目前最大的影響因素是 pH和溫度，所以酶制劑添加點要避開預灰后和二次加熱的高pH和高溫環(huán)境。實際應用中，若是能夠控制反應環(huán)境的 pH和溫度，或是新研制耐受性更好的酶，那么α-葡聚糖酶在多個位點都有良好的預期效果。