CdSe/ZnS量子點(diǎn)的合成及對(duì)阿薩爾吉亞芽孢桿菌標(biāo)記

王小龍 曾紅

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

量子點(diǎn)也叫化學(xué)探針，一般是由II-Vl族或III-V族元素組成的微觀粒子（粒徑在1～10 nm［1］），具有熒光強(qiáng)度高，物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)。量子點(diǎn)可分為單核型和核殼型，單核型量子點(diǎn)有CdSe、ZnS［2］、CdTe［3］，核 殼 型 量 子 點(diǎn) 有CdSe/ZnS［4］，CdS/ZnS［5］，CdSe/CdS［6］等。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，量子點(diǎn)可作為熒光標(biāo)記探針用于標(biāo)記人體干細(xì)胞［7］，還能標(biāo)記植物DNA 上，用于植物生長(zhǎng)發(fā)育研究［8］。關(guān)于量子點(diǎn)用于細(xì)菌的標(biāo)記，也有許多報(bào)道，如CdSe/CdZnS 核殼型量子點(diǎn)成功標(biāo)記在大 腸 桿 菌 上［9］；CdSe 量 子 點(diǎn) 標(biāo) 記 熒 光 假 單 孢 菌（Pseudomonas fluorescensBA3SM1）［10］；CdTe 和CdTe/ZnS 量子點(diǎn)標(biāo)記在大腸桿菌（Escherichia coliDH5a）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenesCMCC54002）、表皮 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus epidermidisCMCC269069） 、變 形 桿 菌（Proteus vulgarisCMCC49027）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosaATCC 27853）、沙門氏菌（Salmonella paratyphiACMCC（B）50093）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、沙雷氏菌屬（Serratia sp）枯草芽孢桿菌B168［11］；復(fù)合型CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記在革蘭氏陰性菌E.coli［12］。而關(guān)于CdSe/ZnS 量子點(diǎn)標(biāo)記在阿薩爾基芽亞孢桿菌上的研究未見(jiàn)報(bào)道。

目前有多種合成CdSe/ZnS 的方法，在有機(jī)相中合成量子點(diǎn)條件苛刻，原料藥價(jià)格高、生物相容性差、而且毒性非常大，且化學(xué)方法合成的量子點(diǎn)需要引入水溶性的基團(tuán)，增加量子點(diǎn)的水溶性并提高其生物相容性。本文基于高艷麗等報(bào)道的方法［13-14］先合成CdSe 量子點(diǎn)再合成CdSe/ZnS 量子點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以提高量子點(diǎn)水溶性和生物相容性。

近年來(lái)，量子點(diǎn)因化學(xué)穩(wěn)定性好、熒光強(qiáng)度強(qiáng)在食品、藥物、微生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，本文合成CdSe/ZnS，標(biāo)記對(duì)棉花黃萎病菌具有拮抗效果的阿薩爾基亞芽孢桿菌，為觀測(cè)其在棉田定殖動(dòng)態(tài)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試試劑與藥品

硒粉，硼氫化鈉，氯化鎘，L-半胱氨酸，硫酸鋅，硫化鈉，巰基乙酸（MAA），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC），巰基丙酸（MPA），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）均為分析純，購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 供試菌株

阿薩爾基亞芽孢桿菌（Bacillus axarquiensisTUBP1），由兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 方法

1.3.1 CdSe量子點(diǎn)的合成方法

先制備前驅(qū)體NaHSe，在50 mL 圓底燒瓶中迅速加入雙蒸水2.0 mL 和0.040 0 g NaHB4，震蕩溶解，然后再加入Se 粉，使二者的比例變?yōu)?∶2，Se 粉過(guò)量，抽真空，通入氮除氧，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)大約2.0 h。先得到前驅(qū)體NaHSe 顏色為無(wú)色透明。同時(shí)量取120 mL 雙蒸水加入250 mL 的圓底燒瓶中，也是在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下加入CdCl2（0. 015 4 g）和巰基乙酸（18 μL MAA），調(diào)節(jié)溶液的pH 至8.0，在隔絕氧氣條件下反應(yīng)30 min，迅速加入新制備的NaHSe，每隔20 min 取樣。有關(guān)方程式如下：

1.3.2 CdSe/ZnS量子點(diǎn)的合成方法

根據(jù)Chan等報(bào)道的方法［15-17］，取60 mL制備好的CdSe 量子點(diǎn)，同時(shí)滴加Na2S 和ZnSO4溶液（在無(wú)氧的條件下進(jìn)行），在溫度為50 ℃反應(yīng)1 h，得到CdSe/ZnS量子點(diǎn)，量子點(diǎn)濃度以溶液中Cd2+含量計(jì)算。最后取CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)20 mg溶于1.0 mL氯仿中，再加入100μL 0.1 mol/L 的巰基丙酸，攪拌過(guò)夜。將溶液洗滌干燥后所得的量子點(diǎn)即為水溶性的巰基丙酸修飾的CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)［18-19］。

1.4 量子點(diǎn)標(biāo)記阿薩爾基亞芽孢桿菌

1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

阿薩爾基亞芽孢桿菌（B.axarquiensisTUBP1）由兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。B.axarquiensisTUBP1接種于NA培養(yǎng)基上，放置在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，并通過(guò)平板計(jì)數(shù)法［19-20］調(diào)整菌懸液濃度為1×107CFU/mL。

1.4.2 量子點(diǎn)標(biāo)記阿薩爾基亞芽孢桿菌

1）阿薩爾基亞芽孢桿菌菌懸液4 000 r/min 離心5～10 min，收集菌體，PBS 洗滌2～3 次，通過(guò)稀釋平板法計(jì)數(shù)。取200μL菌懸液加入偶聯(lián)劑EDC 100μL（濃度為1 mg/mL），攪拌15 min 之后，再加入另外一種偶聯(lián)劑NHS 100 μL（濃度為0. 15 mg/ml），置于37 ℃的搖床繼續(xù)反應(yīng)1.5 h，以不加偶聯(lián)劑者為對(duì)照組。待反應(yīng)完畢后離心收集菌體，無(wú)菌水洗滌3～5遍，菌體重新懸于500μL 無(wú)菌水用于流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。

2）先 將100 μL 濃 度 為1 mg/mL 的EDC 加 入200 μL 不同濃度的量子點(diǎn)中，攪拌15 min。再加入0. 15 mg/mL 的NHS 100 μL，反應(yīng)20 min。最后將上述溶液與細(xì)菌（細(xì)菌的挑取與菌液的制備與上述步驟相同）在37 ℃孵育10～70 min，0.22μm 超濾膜過(guò)濾，收集濾液，以不加粘結(jié)劑（EDC/NHS）者為空白對(duì)照。取500μL菌液用于流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CdSe量子點(diǎn)的結(jié)果分析

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)CdSe熒光強(qiáng)度的影響

紫外-可見(jiàn)分光光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間對(duì)CdSe 量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響，如圖1和圖2所示。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)CdSe 量子點(diǎn)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜的影響a-g分別為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)CdSe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響a-g分別為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min

由圖1 可知，CdSe 量子點(diǎn)在紫外可見(jiàn)區(qū)有明顯吸收峰，從紫外可見(jiàn)吸收峰特征可以初步判斷合CdSe 成量子點(diǎn)合成成功，且隨著反應(yīng)回流時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，吸收峰有紅移現(xiàn)象，預(yù)示量子點(diǎn)納米粒徑逐步變大。由圖2 可知，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度減弱，當(dāng)時(shí)間達(dá)到140 min 時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)峰的位置無(wú)明顯變化，且熒光強(qiáng)度也減弱，這可能是合成的量子點(diǎn)出現(xiàn)了缺陷，影響熒光強(qiáng)度。反應(yīng)20 min 時(shí)，雖然熒光強(qiáng)度比較強(qiáng)，但是紫外吸收峰較寬，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇NaHSe 和CdCl2反應(yīng)時(shí)間為40 min。

2.1.2 合成溫度對(duì)CdSe熒光強(qiáng)度的影響

考察反應(yīng)溫度（20 ℃，30 ℃，60 ℃和90 ℃）對(duì)CdSe 量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響，其他反應(yīng)條件相同，分別為反應(yīng)時(shí)間40 min，Cd∶Se 配比為2∶1，加入MAA 的量為18 μL。由圖3 和圖4 可知，當(dāng)其他反應(yīng)條件相同（時(shí)間40 min、Cd∶Se 配比為2∶1，加入MAA 的量為18μL）時(shí)，隨著溫度的升高，合成的量子點(diǎn)吸收峰位置向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，且熒光強(qiáng)度也相應(yīng)減弱。但是溫度太低時(shí)，反應(yīng)速率會(huì)比較慢。因而確定最佳反應(yīng)溫度為30 ℃。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)CdSe量子點(diǎn)紫外-可見(jiàn)吸收光譜的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)CdSe 量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響

2.1.3 pH值對(duì)CdSe熒光強(qiáng)度的影響

由圖5可知，當(dāng)溶液的pH 值大于8.0時(shí)，隨著pH值的升高，量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸降低，而pH 值小于8.0 時(shí)，熒光強(qiáng)度也會(huì)下降。熒光強(qiáng)度在pH 為8.0時(shí)達(dá)到最高值，所以選擇最佳反應(yīng)pH為8.0。

圖5 pH對(duì)CdSe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響溫度30 ℃，Cd:Se=2:1，反應(yīng)時(shí)間40 min

2.1.4 最佳Cd∶Se配比對(duì)CdSe熒光強(qiáng)度的影響

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，固定加入巰基乙酸（MAA）的量，當(dāng)反應(yīng)溫度為30 ℃，回流時(shí)為40 min，改變Cd∶Se 物質(zhì)的量之比（1∶1、2∶1、3∶1），選擇最佳的Cd∶Se 配比。由圖6 可知，其他條件一致的情況下，Cd 量減少時(shí)，量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度隨之減弱，當(dāng)Cd∶Se 比例為1∶1 時(shí)，溶液有沉淀析出，無(wú)法得到較好的量子點(diǎn)，當(dāng)Cd∶Se 配比為2∶1 時(shí)，能得到亮黃色透明溶液，且能保存數(shù)月。當(dāng)Cd∶Se 配比為3∶1時(shí)，合成出來(lái)的量子點(diǎn)也具有較強(qiáng)熒光，但是不及Cd∶Se 配比為2∶1 的熒光強(qiáng)度。綜合考慮，最佳Cd∶Se 配比確定為2∶1。

圖6 Cd:Se比例對(duì)CdSe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響

穩(wěn)定劑對(duì)量子點(diǎn)的影響十分大，本文選取巰基乙酸（MAA）作為穩(wěn)定劑，合成CdSe水溶性量子點(diǎn)，并對(duì)探究一系列因素（Cd∶Se 物質(zhì)的量配、反應(yīng)溫度、回流時(shí)間、溶液的pH 等）對(duì)CdSe 量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果如圖6 可知，Cd∶Se 的物質(zhì)量摩爾比為2∶1，溫度為30 ℃，時(shí)間為40 min，pH 為8 時(shí)，合成的量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，分散性好，且合成的量子點(diǎn)的熒光峰在550 nm，測(cè)定時(shí)的激發(fā)波長(zhǎng)為420 nm。

2.2 CdSe/ZnS量子點(diǎn)

由圖7 可知，核殼型量子點(diǎn)CdSe/ZnS 在450 nm處有最大吸收峰，核殼型量子點(diǎn)特征吸收比較明顯。

2.3 量子點(diǎn)標(biāo)記阿薩爾基亞芽孢桿菌結(jié)果

量子點(diǎn)標(biāo)記阿薩爾基亞芽孢桿菌結(jié)果如圖8 所示，CdSe 和CdSe/ZnS 量子點(diǎn)標(biāo)記阿薩爾基亞芽孢桿菌分別9%和10%（8A-B），核殼型CdSe/ZnS 量子點(diǎn)標(biāo)記率略高于單核型CdSe量子點(diǎn)。CdSe/ZnS量子點(diǎn)按照阿薩爾吉亞芽孢桿菌菌液→加入量子點(diǎn)→加入EDC→加入NHS→加入PBS順序進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記率為15%，而按照EDC→加入量子點(diǎn)→NHS→加入阿薩爾吉亞芽孢桿菌菌液標(biāo)記，標(biāo)記率為24%，CdSe/ZnS 量子點(diǎn)加入偶聯(lián)劑EDC 和NHS后標(biāo)記阿薩爾基亞芽孢桿菌效率較不加入偶聯(lián)劑時(shí)高，可能是菌液和偶聯(lián)劑分散性好導(dǎo)致標(biāo)記效率提高。

圖7 核殼型量子點(diǎn)CdSe/ZnS表征

圖8 CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記阿薩爾吉亞芽孢桿菌

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)探究了水溶性量子點(diǎn)CdSe的合成方法及不同回流時(shí)間、不同溫度、不同pH 值和不同Cd∶Se 配比等因素對(duì)其熒光強(qiáng)度和分散性的影響。探討CdSe/ZnS［20-21］量子點(diǎn)經(jīng)巰基丙酸（MPA）修飾后熒光強(qiáng)度和吸收峰的影響，并嘗試用量子點(diǎn)標(biāo)記阿薩爾基亞芽孢桿菌，進(jìn)一步研究了偶聯(lián)劑對(duì)量子點(diǎn)標(biāo)記芽孢桿菌的標(biāo)記效率的影響。

通過(guò)上述方法成功使用量子點(diǎn)對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行了標(biāo)記，圖8 標(biāo)記結(jié)果可以看出，加入EDC 和NHS 偶聯(lián)劑的樣本標(biāo)記效率比不加偶聯(lián)劑的樣本的標(biāo)記效率要高。這可能是應(yīng)為量子點(diǎn)經(jīng)過(guò)巰基丙酸修飾后，在量子點(diǎn)表面引入了羧基，粘結(jié)劑（EDC）進(jìn)而可以和羧基發(fā)生反應(yīng)，形成中間體，穩(wěn)定的中間體和阿薩爾基亞芽孢桿菌的表面上的氨基結(jié)合。復(fù)合型量子點(diǎn)CdSe/ZnS 按照菌液→量子點(diǎn)→EDC→NHS→PBS緩沖液依次加入，EDC并沒(méi)有充分發(fā)揮作用生成中間體，而NHS 也作用甚微，這造成了量子點(diǎn)大面積的聚集，這樣量子點(diǎn)就不能充分與菌體結(jié)合。CdSe/ZnS量子點(diǎn)按照EDC→量子點(diǎn)→NHS→菌液→PBS緩沖液的順序加入，讓量子點(diǎn)與EDC 充分結(jié)合之后再與細(xì)菌結(jié)合便能極大地提高量子點(diǎn)的標(biāo)記效率［21-22］，本實(shí)驗(yàn)也證明了先加粘結(jié)劑后加菌懸液，可以提高量子點(diǎn)的標(biāo)記率。

本文首先合成水溶性量子點(diǎn)，并用MPA 修飾，可用于標(biāo)記有抗菌作用的阿薩爾基亞芽孢桿菌。合成CdSe 量子點(diǎn)以后，再進(jìn)行巰基乙酸修飾，合成了CdSe/ZnS 核殼型量子點(diǎn)，并探究了兩種量子點(diǎn)在EDC 和NHS 偶聯(lián)劑作用下對(duì)阿薩爾基芽孢桿菌的標(biāo)記效率。本文為建立生防菌阿薩爾吉亞芽孢桿菌的熒光探針標(biāo)記提供新的思路。