四種小鼠功能性便秘模型制備的比較研究*

陽艾玲，閆怡欣，何昊，高亞，賀葵，石慧，劉珉甬

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理器械研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000）

便秘發(fā)生率受人群生活方式、壽命延長(zhǎng)、精神狀況等因素影響逐年上升，達(dá)2.0%～28.0%，若未及時(shí)治療可能誘發(fā)心腦血管、大腸癌等疾病，導(dǎo)致患者抑郁焦慮，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[1-3]。功能性便秘指排除繼發(fā)因素導(dǎo)致的便秘，占便秘的43.6%[4]。國(guó)內(nèi)外對(duì)便秘的研究主要以手術(shù)切除的人體標(biāo)本為主，缺乏前瞻性的研究資料。已有文獻(xiàn)報(bào)道的手術(shù)治療便秘的效果、并發(fā)癥、復(fù)發(fā)率等存在爭(zhēng)議[5]。研發(fā)功能性食品治療便秘是大勢(shì)所趨，評(píng)價(jià)受試物的療效需找到安全有效的動(dòng)物模型。因此，本研究通過比較四種小鼠便秘模型，找到簡(jiǎn)單高效的造模方法，為研發(fā)治療便秘藥物提供模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)（無特定病原體動(dòng)物）昆明小鼠（Kunming mice,KM小鼠）50只［西南醫(yī)大動(dòng)物中心提供SCXK（川）2013-17］，18.00～22.00 g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只。本研究已通過西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查，遵照動(dòng)物福利進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 炭粉液[6]（首粒黑便指示劑）：加水400.00 ml將阿拉伯樹膠（博研生物）100.00 g配成0.25%透明溶液，將活性炭粉（明洋化工）50.00 g加至上述溶液中煮沸3次，冷卻后加水定容至500.00 ml,于4℃冰箱保存，臨用前搖勻，并加入等量蒸餾水，制得炭粉液待用。

復(fù)方地芬諾酯（康普藥業(yè)H32022716）混懸液[7]：2片復(fù)方地芬諾酯片（2.50 mg/片）研磨成粉，加入2.50 ml水均勻混合。

洛哌丁胺（楊森制藥H10910085）溶劑[8-9]：1粒洛哌丁胺加入1.00 ml水中均勻混合。

冰水[7]：生理鹽水（美大康18030542）制成0℃～4℃的冰水。

硫糖鋁（白敬宇制藥150602）溶劑[10]：取1片硫糖鋁（0.25 g/片）研磨成粉，加入50.00 ml水均勻混合。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

復(fù)方地芬諾酯組：復(fù)方地芬諾酯混懸液10.00 mg/kg灌胃1次；洛哌丁胺組：洛哌丁胺混懸液9.38 mg/kg灌胃，2次/d，首次給藥加倍，連續(xù)10天；冰水組：0℃冰水灌胃0.80 ml/（只·d），連續(xù)7天；硫糖鋁組：硫糖鋁混懸液灌胃25.00 mg/ （kg·d），連續(xù)3天，第3天劑量減半；空白組 ：生理鹽水0.10 ml/（只·d）灌胃，連續(xù)10天。

各組小鼠在給藥前一天和最后一次灌胃30分鐘后分別給予炭粉液（給藥量為0.1 ml/10 g）測(cè)定糞便參數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般觀察 小鼠活動(dòng)度、毛色、精神狀況、體質(zhì)量、飲水量、進(jìn)食量。

1.3.2 糞便參數(shù) 用炭粉指示液記錄首粒排黑便時(shí)間，收集4 h后糞便數(shù)量，用電子天平稱其質(zhì)量（濕重）。每次收集的糞便稱重之后烘干，稱其干重。含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.3 病理學(xué) 造模結(jié)束，隨機(jī)抽樣30只小鼠處死，剪取距遠(yuǎn)端結(jié)腸8～10 mm組織做病理切片，觀察遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜層厚度及細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，分別采用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)、單因素方差分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

5個(gè)實(shí)驗(yàn)組造模前后自身對(duì)照體重、進(jìn)食量、飲水量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05（復(fù)方地芬諾酯組：F體重=1.15、F進(jìn)食量=61.50、F飲水量=38.36；洛哌丁胺組：F體重=54.30、F進(jìn)食量=32.18、F飲水量=38.36；冰水組：F體重=77.44、F進(jìn)食量=47.77、F飲水量=191.61；硫 糖鋁組：F體重=10.25、F進(jìn)食量=33.62、F飲水量=63.20；空白組：F體重=274.90、F進(jìn)食量=32.93、F飲水量=23.66）。造模后四個(gè)模型組與空白組比較，僅洛哌丁胺組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.09，P＜0.01）。見表1。

2.2 糞便參數(shù)

①造模前后首粒排黑便時(shí)間：4個(gè)模型組與空白組比較，僅復(fù)方地芬諾酯組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.71，P＜0.001）。②造模前后4 h排便數(shù)量：4個(gè)模型組與空白組比較，復(fù)方地芬諾酯組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=81.59，P＜0.001）；洛哌丁胺組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.65，P＜0.001）。③造模前后糞便含水量：4個(gè)模型組中僅復(fù)方地芬諾酯組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 病理學(xué)觀察

2.3.1 黏膜層厚度 5組中僅復(fù)方地芬諾酯組粘膜層變薄程度、腸腔擴(kuò)張情況最為明顯。見圖1。

2.3.2 細(xì)胞形態(tài)變化 5組中僅復(fù)方地芬諾酯組杯狀細(xì)胞萎縮最明顯且形態(tài)細(xì)長(zhǎng)。見圖2。

表1 各組小鼠一般情況比較 （±s,n=10）

表1 各組小鼠一般情況比較 （±s,n=10）

注：1）與造模前比較，P＜0.05；2）與空白組比較，P＜0.01。

組別 造模前造模后體重/g 進(jìn)食量/g 飲水量/ml 體重/g 進(jìn)食量/g 飲水量/ml復(fù)方地芬諾酯組 20.90±0.77 3.50±0.11 1.60±0.52 20.55±0.691） 4.11±0.221） 3.20±0.631）洛哌丁胺組 18.30±1.25 3.44±0.17 1.60±0.52 21.65±0.711）2） 4.09±0.321） 3.20±0.631）冰水組 17.89±0.78 3.44±0.17 1.70±0.21 20.94±0.771） 4.33±0.371） 3.00±0.211）硫糖鋁組 18.75±1.80 3.53±0.20 1.80±0.42 20.85±1.031） 4.35±0.401） 3.50±0.531）空白組 17.25±0.35 3.48±0.18 1.70±0.67 20.45±0.501） 4.01±0.231） 2.80±0.251）

表2 各組小鼠排便指標(biāo)比較 （±s,n=10）

表2 各組小鼠排便指標(biāo)比較 （±s,n=10）

注：1）與造模前比較，P＜0.05；2）與空白組比較，P＜0.001。

組別 造模前造模后首粒黑便時(shí)間/min 糞便含水量/% 4 h糞便數(shù)量/粒 首粒黑便時(shí)間/min 糞便含水量/% 4 h糞便數(shù)量/粒復(fù)方地芬諾酯組 51.30±20.33 18.00±6.00 35.50±1.69 146.30±31.631）2） 11.00±9.001） 15.30±2.121）2）洛哌丁胺組 41.40±14.46 20.00±5.00 42.30±3.89 44.30±6.16 17.00±12.00 15.50±7.811）2）冰水組 38.89±9.45 20.00±6.00 45.33±9.76 57.00±12.451） 23.00±10.00 36.33±8.411）硫糖鋁組 41.80±9.92 17.00±3.00 39.10±5.90 63.80±16.741） 15.00±10.00 42.90±3.001）空白組 61.40±19.27 14.00±3.00 43.30±5.95 60.00±20.31 15.00±1.00 43.30±9.57

圖1 小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸粘膜層厚度

圖2 小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸細(xì)胞形態(tài)

3 討論

便秘因腸道蠕動(dòng)力下降，肌張力低下，排便無力，糞便滯留而形成。小鼠是制備便秘模型的常用動(dòng)物，本實(shí)驗(yàn)通過制備4種便秘模型，選擇出最有效便捷的造模方法，用于治療便秘藥物的實(shí)驗(yàn)研究。

洛哌丁胺組造模后4 h糞便顆粒減少，杯狀細(xì)胞體積變小，連續(xù)10天的多次灌胃對(duì)小鼠咽喉部損傷較大，易致嗆咳窒息，不良反應(yīng)多[11]，不能成功模擬功能性便秘。

冰水組造模使小鼠首粒排便時(shí)間延長(zhǎng)、4 h排便數(shù)量減少。連續(xù)7天操作使小鼠煩躁不安且抗拒灌胃，刺激胃腸功能，易致小鼠痙攣死亡，維持性不佳。

硫糖鋁組懸濁液配制時(shí)溶液量較大，造模后首粒排便時(shí)間稍延長(zhǎng)，粘膜層部分變薄，杯狀細(xì)胞萎縮、干癟不明顯，造模效果不如復(fù)方地芬諾酯組。

復(fù)方地芬諾酯組一次灌胃成模，操作簡(jiǎn)單有效，能有效避免復(fù)方地芬諾酯的成癮性。與其它3個(gè)造模組相比，該組首粒黑便時(shí)間顯著延長(zhǎng)，糞便含水量、4 h糞便數(shù)量顯著減少，黏膜層變薄使腸腔明顯擴(kuò)張，腸推動(dòng)力下降，杯狀細(xì)胞萎縮最明顯且形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，達(dá)到預(yù)期便秘效果，成功造模。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比小鼠體重、進(jìn)食量、飲水量、首粒黑便時(shí)間、糞便含水量、4 h糞便總量、結(jié)腸粘膜層厚度和細(xì)胞形態(tài)變化等指標(biāo)對(duì)造模效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以復(fù)方地芬諾酯建立便秘模型效果最佳，此方法也是目前便秘研究中使用較多的方法[12]，可選用該模型做治療便秘的有效性研究,為相關(guān)便秘產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。