CCL23在肝細胞癌中的表達及其對預后的影響

汪建業(yè) 趙之聰 侯嘉杰 夏強

趨化因子在多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用，例如白細胞轉移、免疫應答、細胞遷移和細胞增殖等[1，2]。近年來，趨化因子在肝癌中的作用受到廣泛關注，它們一方面可以募集免疫細胞增強免疫反應發(fā)揮抗腫瘤作用，另一方面也可以促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲。CCL23(又稱MPIF-1，MIP-3或CKβ-8)基因位于染色體17q12，最早是從人主動脈內皮細胞和人單核細胞系THP-1中發(fā)現(xiàn)的，在多種組織中表達，包括闌尾，結腸和膽囊等。它通過受體CCR1對單核細胞、樹突狀細胞和T淋巴細胞具有趨化活性，并對粒-單核系祖細胞的增殖具有抑制作用[3-5]，但CCL23在惡性腫瘤中的作用鮮有報道。本研究從公用數(shù)據(jù)庫中篩選出在肝癌和癌旁肝組織中表達差異明顯的CCL23，通過實時熒光定量PCR及免疫組織化學法進一步驗證CCL23在肝癌組織中的表達。

資料和方法

一、基于肝細胞癌的數(shù)據(jù)分析

通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載公共肝癌芯片數(shù)據(jù)(GSE14520，GSE25097，GSE57957，GSE57958，GSE64041)，TCGA-LIHC數(shù)據(jù)庫獲取(http://tcgadata.nci.nih.gov)374例肝癌及50例正常肝組織基因表達譜，通過Perl語言生成“基因表達矩陣文件”，并分析相關基因變化。

二、臨床樣本選取及隨訪

收集2014年2月至2016年2月上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院的196例行根治性肝切除術的肝癌患者組織標本及臨床病理資料，并制作肝癌組織芯片。另外隨機選擇82個HCC組織標本，同時選取配對的癌旁正常組織標本。肝癌組織選擇：①術前臨床診斷為原發(fā)性肝癌及術后病理確診為肝細胞肝癌；②臨床病理資料完整；③癌旁正常組織距肝癌組織>2 cm。④排除非腫瘤原因死亡者。術后以門診和電話形式進行隨訪，從手術日開始計算存活時間和無復發(fā)存活時間。

三、免疫組織化學

將組織芯片脫蠟，水合，通過檸檬酸鹽抗原修復溶液(用PBS稀釋)在微波條件下修復，CCL23單克隆抗體(英國Abcam公司，ab171751)以1∶100稀釋，并用1%BSA稀釋為陰性對照，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗(購自美國Jackson公司)以1∶200稀釋。染色評估：使用Image pro plus 軟件讀取圖像IA值，并根據(jù)IA值來評價肝組織中的CCL23的表達強度。

四、實時熒光定量聚合酶鏈反應

隨機選擇82對癌與癌旁組織。根據(jù)Biotech RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，并反轉錄成互補的脫氧核糖核酸(cDNA)。Nanodrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，美國)測量RNA濃度及純度，并根據(jù)SYBR Green I Master Mix方案，反應體系10 μL，β-actin作為內參進行實時熒光定量PCR。 PCR：95℃ 5 min; 95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環(huán); 95℃，5 s，65℃，1 min。引物序列為： CCL23正向引物：5′-CATCT-CCTACACCCCACGAAG-3′，反向引物：5′-GGGT-TGGCACAGAAACGTC-3′；β-actin正向引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACAT-TAAG-3′，β-actin反向引物：5′-TGTGTTGGCGTA-CAGGTCTTTG-3′。

五、統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 7.0或SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。配對t檢驗用于分析肝癌及癌旁組織中CCL23表達的差異，Kaplan-Meier和Log-rank檢驗用于生存分析，單因素和多因素Cox回歸模型用于分析CCL23表達水平對于預后的影響，卡方檢驗用于分析CCL23表達水平與臨床病理學特征之間的關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、不同趨化因子在肝癌中的表達

為了篩選出在肝癌發(fā)展中起重要作用的趨化因子，研究了GSE25097隊列以及TCGA中所有趨化因子基因的表達譜，將配對肝癌和癌旁的表達譜進行差異表達分析，結果顯示，與正常組織相比，GSE14520及TCGA數(shù)據(jù)庫中分別有35、38種趨化因子基因表達發(fā)生顯著下調。見表1。在這兩個隊列中，除去CXCL14后(其在數(shù)據(jù)庫中對患者總體預后影響并不明顯)，CCL23的差異倍數(shù)(foldchange, FC)及差異的顯著性變化都最為明顯(TCGA：FC=0.132873932,P值=2.31217E-88; GSE25097：FC=0.130784185,P值=1.15E-72)。

二、CCL23在公共數(shù)據(jù)庫中的表達、與臨床病理相關性及患者預后的關系

進一步驗證隊列(GSE57957，GSE64041)發(fā)現(xiàn)CCL23在肝癌組織中的表達普遍下調(所有數(shù)據(jù)經標準化處理)(圖1 A)。在TCGA以及GSE14520隊列中，將患者分為高表達和低表達組，并繪制Kaplan-Meier曲線，結果提示，CCL23高表達組的總體生存率(TCGA：P=0.0026，GSE14520：P=0.0014)(圖2 B)和無復發(fā)生存率(TCGA：P=0.0306，GSE14520：P=0.0189)(圖1 C)均顯著延長。其與臨床病理指標構建四個表并做卡方檢驗發(fā)現(xiàn)，肝癌中的CCL23表達水平僅與腫瘤數(shù)目(P=0.019)明顯相關。此外，在GSE14520隊列中，通過單因素及多因素分析發(fā)現(xiàn)，CCL23表達水平(P=0.002)、肝硬化(P=0.020)和BCLC分期(P<0.01)是總生存時間的影響因素，而CCL23表達水平(P<0.01)和性別(P=0.024)是影響肝癌患者無瘤生存時間的影響因素。見表2，3。

表1 公共數(shù)據(jù)庫中趨化因子基因差異表達

三、CCL23在肝癌患者中的表達及與患者預后的關系

通過qRT-PCR對82例肝癌及配對癌旁組織中進一步驗證CCL23 mRNA的表達水平，結果顯示肝癌組織中CCL23表達明顯低于癌旁組織(P<0.01)(圖2 A)。此外，通過免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，在已有的70對癌和癌旁肝組織芯片中，CCL23陽性強度明顯高于癌旁組織(圖2 D)。根據(jù)染色強度，將肝癌組織中CCL23分為高表達(n=97)和低表達(n=99)兩組，結果顯示，CCL23高表達者的總生存時間和無瘤生存時間上都明顯優(yōu)于CCL23低表達的患者(P<0.01)(圖2 B&C)；與各項臨床病理指標構建四格表并做卡方檢驗發(fā)現(xiàn)，肝癌中的CCL23表達水平與病理分級(P=0.003)明顯相關，而與年齡、性別、HBV、腫瘤大小甲胎蛋白、腫瘤數(shù)目、ALT、衛(wèi)星病灶及肝硬化無關(表4)。另外，將各項病理指標分別做單因素COX回歸分析，然后將差異有統(tǒng)計學意義的指標納入多因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中CCL23水平(P=0.002)、腫瘤大小(P<0.01)、腫瘤數(shù)目(P=0.005)和甲胎蛋白(P=0.041)是影響肝癌患者術后總生存時間的獨立危險因素，而CCL23水平(P<0.01)、腫瘤大小(P<0.001)和甲胎蛋白(P=0.015)是影響肝癌患者術后無瘤生存時間的獨立危險因素(表5)。

表2 GSE14520中CCL23和臨床病理學特征之間的相關性

注：A.在公共數(shù)據(jù)庫中，CCL23在肝癌與癌旁組織中的差異；B.在 TCGA-LIHC隊列； C.GSE14520隊列中，肝癌組織中CCL23表達與患者預后的關系

圖1CCL23在公共數(shù)據(jù)中的表達及與患者預后的關系

注：A.82例肝癌患者中，CCL23在肝癌與癌旁組織中的差異； B和C.肝癌組織中的CCL23高表達與患者預后的關系； D.CCL23在肝組織中的免疫組織化學染色(左：肝癌組織；右：配對癌旁組織：左上：肝癌組織中的CCL23低表達患者；左下：肝癌組織中CCL23高表達患者，放大倍數(shù)：200倍)

圖2 CCL23在肝癌患者中的表達及與患者預后的關系

注：NA為未被采納

表4 HCC中CCL23和臨床病理學特征之間的相關性

討 論

目前已經在多種疾病中發(fā)現(xiàn)趨化因子的重要作用，尤其是在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中。例如，Zhang等[6]分析人肝癌的預后生物標志物的微陣列發(fā)現(xiàn)，CCL14明顯下調，并且對肝癌細胞增殖有影響。Wang等[7]通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)多個趨化因子是肝癌預后的獨立危險因素，其中XCR1對肝癌患者預后影響最顯著。此外，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中，趨化因子配體-受體的相互作用發(fā)揮著重要作用，例如CXCL12-CXCR4/CXCR7可以促進肝癌的增殖[8，9]，CX3CL1-CX3CR1可抑制肝癌細胞的增殖[10]，CCL20可以增強肝癌細胞的增殖和轉移能力等[11]。

本研究首先在GSE14520隊列探討各個趨化因子在肝癌及癌旁組織中的表達水平，然后在其他公共數(shù)據(jù)庫中驗證發(fā)現(xiàn)，CCL23的表達差異最為顯著。已知CCL23可以特異性募集靜息T淋巴細胞和單核細胞、抑制髓系祖細胞增殖、促進血管形成，還可以負性調節(jié)人臍帶血CD34+細胞的增殖等[12]。本研究證實了CCL23在肝癌組織中表達明顯下調，其表達水平與腫瘤數(shù)目及病理分級相關，提示其可能參與腫瘤細胞的分化和增殖，其中高表達者的總生存時間及無瘤生存時間顯著延長，表明CCL23可能抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。此外，CCL23與其受體CCR1結合，可以募集單核細胞，樹突狀細胞和T淋巴細胞，并且可通過CCR1誘導內皮細胞遷移和血管生成，但CCL15-CCR1軸可增強肝癌細胞的轉移[13]、CCL3-CCR1軸可促進肝癌細胞增殖和侵襲[14]，表明在肝癌中CCL23可能不是主要通過CCR1發(fā)揮作用。綜上所述，趨化因子CCL23可以作為肝癌術后遠期生存復發(fā)的預測指標，為今后的肝癌治療靶點提供理論基礎。

表5 HCC中CCL23的單因素和多因素Cox回歸分析