益生菌噴霧干燥影響機(jī)制及優(yōu)化策略分析

肖懷秋，李玉珍，林親錄，趙謀明，劉軍

1(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲，412004) 2(中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙，410004)3(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510640)

益生菌(probiotics)是指具有維持人體內(nèi)菌群平衡，對(duì)人體健康產(chǎn)生有益作用的微生態(tài)制劑。口服足量活性益生菌有助于緩解急慢性胃腸炎、治療腹泄、改善消化，緩解乳糖不耐癥等癥狀[1]。Science和Cell等國際頂級(jí)期刊發(fā)表論文指出，特定益生菌及腸道菌群在減少病原菌在腸內(nèi)定植和生長、提升免疫力、緩解神經(jīng)發(fā)育障礙等方面具有顯著功能[2-3]。常見益生菌主要源自革蘭氏陽性的乳酸桿菌屬、乳酸球菌屬、雙歧桿菌屬及部分酵母，其菌體制劑分為液體制劑和固體制劑。前者是通過傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)并最終獲得益生菌菌液作為制劑產(chǎn)品，后者則由益生菌經(jīng)增殖后，通過凍干、噴霧干燥或包埋等手段加工成固體制劑形式。液態(tài)制劑隨著保藏時(shí)間延長易受污染或菌種退化，使用前需活化培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)，而固態(tài)菌劑可直投，發(fā)酵前不需擴(kuò)大培養(yǎng)，保藏費(fèi)用較低。目前，益生菌固體制劑工藝常有真空冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥、微波真空干燥等。真空冷凍干燥適用熱敏性益生菌干燥，菌體亞細(xì)胞損傷少、活菌率高，但易受預(yù)凍溫度、冷凍速度和真空度等因素影響，耗時(shí)長、費(fèi)用高；流化床干燥干燥時(shí)間較長，當(dāng)物料停留時(shí)間不均勻時(shí)，存在干燥不均勻等情況；微波真空干燥通過極性分子(如菌體水分)隨微波頻率做同步高速旋轉(zhuǎn)，物料瞬時(shí)產(chǎn)生摩擦熱，導(dǎo)致物料表面和內(nèi)部同時(shí)升溫，使大量菌體水分子逸出，實(shí)現(xiàn)干燥，但存在微波分布不均勻，溫度一致性不好等問題，且無法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；僮?。噴霧干燥是直接將制備好的菌懸液經(jīng)過霧化裝置噴霧成霧狀，并在干燥室內(nèi)與高溫空氣直接接觸進(jìn)行傳熱傳質(zhì)，干燥時(shí)間極短，物料溫度較低，產(chǎn)品分散性和溶解性較好，過程簡單，設(shè)備成本相對(duì)較低，特別適用于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，在藥品、食品領(lǐng)域被廣泛使用[4]。本文回顧了益生菌噴霧干燥的基本原理，對(duì)影響噴霧干燥因素進(jìn)行系統(tǒng)而全面的分析，并提出益生菌噴霧干燥工藝優(yōu)化策略，以期促進(jìn)噴霧干燥技術(shù)在益生菌干燥中的應(yīng)用。

1 益生菌噴霧干燥基本原理

噴霧干燥法是將擬干燥的益生菌菌體霧化成非常細(xì)微的霧滴，并依靠干燥介質(zhì)(如熱空氣)與益生菌霧滴均勻混合，通過熱質(zhì)交換使溶劑氣化從而獲得干燥的益生菌菌體。典型生產(chǎn)工藝如圖1所示[4]。

圖1 典型噴霧干燥器的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Typical structure sketch of spray dryer

具體噴霧干燥過程如下：經(jīng)增殖培養(yǎng)的益生菌菌體經(jīng)預(yù)處理后由料泵從塔頂進(jìn)入噴霧干燥塔，由噴頭霧化為直徑約20～100 μm的益生菌液滴并與熱空氣(120～180 ℃)接觸。進(jìn)入噴霧干燥塔的熱空氣經(jīng)除濕、加熱后由干燥塔頂端進(jìn)入塔內(nèi)并與霧化的益生菌液滴進(jìn)行順流干燥。由于益生菌菌體微小，具有極大的比表面積，與熱空氣有良好的熱質(zhì)交換，可在幾秒至幾十秒內(nèi)迅速脫水干燥，從而制備成益生菌菌粉；益生菌菌粉隨后進(jìn)入袋式過濾器，廢空氣則由過濾器頂端排出，實(shí)現(xiàn)空氣與益生菌干菌體的分離。菌體由袋式過濾器收集后直接制備成益生菌菌粉。部分益生菌菌體經(jīng)袋式過濾器分離后水分達(dá)不到質(zhì)量要求，可進(jìn)入流化床干燥器進(jìn)一步除去水分，再制備成益生菌菌粉。噴霧干燥作為一種常用的干燥技術(shù)，在條件優(yōu)化情況下，可進(jìn)行幾十毫升至幾噸的物料干燥。

2 益生菌噴霧干燥影響因素分析

研究益生菌菌體存活率的影響因素對(duì)保護(hù)益生菌和減少益生菌生理功能的損失具有重要作用[5]。

2.1 益生菌菌株本身

益生菌在極端條件或受熱條件下可誘導(dǎo)產(chǎn)生熱激蛋白，與益生菌菌體熱耐受性有重要關(guān)系。一般對(duì)數(shù)生長末期和穩(wěn)定期菌體的熱耐受性較好，通過預(yù)處理可提高益生菌菌體耐受性。DESMOND等將L.rparacaseiNFBC338用0.3 mol/L NaCl預(yù)處理30 min增強(qiáng)了菌體耐受性[6]；陸英等[7]將7 h菌齡的酪乳桿菌L.caseiBD- Ⅱ50 ℃預(yù)處理45 min，菌體熱耐受性提高了2.11倍；TEIXEIRA等[8]對(duì)處于不同生長階段的L.bulgaricus進(jìn)行熱激處理并研究了存活率，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期菌體熱耐受性比對(duì)數(shù)生長期菌體要好，對(duì)數(shù)生長期菌體存活率相對(duì)穩(wěn)定期要低[9]。GOLOWCZYC等在相同噴霧干燥條件下對(duì)CIDCA 83114、L.kefirCIDCA 8348和S.lipolyticaCIDCA 812三株乳酸菌耐熱性進(jìn)行對(duì)比分析，研究發(fā)現(xiàn)，3株乳酸菌表現(xiàn)不同耐熱性，其熱耐受性存在顯著差異[10]；CORCORAN等[11]對(duì)比分析了L.rhamnosusE800、L.salivariusUCC500和L.rhamnosusGG的耐熱性，發(fā)現(xiàn)益生菌菌體熱耐受性存在差異，L.rhamnosusE800熱耐受性最好；YANG等[12]對(duì)比分析了Mg2+對(duì)益生菌L.rhamnosusGG,L.caseiZhang和L.plantarumP-8熱耐受性的影響，研究發(fā)現(xiàn)，Mg2+能提高這3株乳酸菌的熱耐受性，特別是L.rhamnosusGG，Mg2+在20 mmol/L條件下，L.rhamnosusGG存活率提高了近100倍，且熱誘導(dǎo)熱激蛋白時(shí)間明顯縮短。由此可見，由于菌株生理特點(diǎn)不同導(dǎo)致菌體熱耐受性有一定區(qū)別，菌體熱耐受性可通過不同方式進(jìn)行熱誘導(dǎo)來提升。

2.2 培養(yǎng)基成分

在益生菌培養(yǎng)基中添加特定成分(如糖、氨基酸等)可提高益生菌菌體存活率，主要是由于在高熱和低水分條件下微生物可產(chǎn)生可溶性物質(zhì)來減少因滲透壓改變?cè)斐傻膩喖?xì)胞損傷。需注意的是，乳酸菌無法合成這類可溶性物質(zhì)，在乳酸菌培養(yǎng)過程中添加這些物質(zhì)可減少乳酸菌細(xì)胞膜亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熱損傷。CARVALHO等[13]和SILVA等[14]認(rèn)為在培養(yǎng)基中添加乳糖和蔗糖可增強(qiáng)菌株熱耐受性和提高噴霧干燥過程中活細(xì)胞耐熱性和存活率。不同糖類代謝產(chǎn)物對(duì)益生菌保護(hù)作用有顯著差異。如P.aeruginosa發(fā)酵蔗糖和果糖產(chǎn)生的甘露醇在低水分條件下可減少益生菌菌體受到熱損傷；乳酸菌可利用乳糖和蔗糖等產(chǎn)生表多糖(EPS)黏附在細(xì)胞壁上減少乳酸菌熱氧化損傷[15]。KETS等[16]認(rèn)為，在培養(yǎng)基中添加甜菜堿可增強(qiáng)益生菌的耐熱性，能減少高溫和干燥脫水對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷。CORREA等[17]研究了L.rhamnosusCRL1505的熱耐受性，在磷酸緩沖溶液中55 ℃熱誘導(dǎo)20 min比60 ℃熱誘導(dǎo)5 min能更好地提高菌體的熱耐受性，在含10%脫脂奶粉的培養(yǎng)基中加入KH2PO4, Na2HPO4, MnSO4和MgSO4等無機(jī)鹽能提高菌體存活率，并利用TEM監(jiān)測(cè)了細(xì)胞形態(tài)的變化。研究認(rèn)為，在無機(jī)鹽和高濃度多磷酸鹽存在情況下，能提高益生菌菌體對(duì)熱激的耐受性。

2.3 保護(hù)劑

在噴霧干燥過程中添加保護(hù)劑是益生菌菌粉制備中的常用策略，可分為單一型保護(hù)劑(如葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、枸杞多糖等)和復(fù)合型保護(hù)劑(如蔗糖+麥芽糊精等)。由于海藻糖在失水部位以氫鍵和磷脂極性端相連，防止膜相變和復(fù)水時(shí)滲漏，可起到保護(hù)益生菌的作用；AGUDELO等[18]以乳清分離蛋白和麥芽糖糊精作為載體，對(duì)比研究了膠囊化的L.rhamnosus益生菌在有蔗糖或海藻糖保護(hù)劑及無保護(hù)劑的條件下的生存活性，研究認(rèn)為，在蔗糖或海藻糖的保護(hù)作用下，益生菌的生存活性明顯得到改善。復(fù)合型保護(hù)劑如蔗糖+麥芽糖糊精可將L.bulgaricus噴霧干燥后菌株存活率由0.01%提高到7.8%[19]。復(fù)合型保護(hù)劑成分一般為脫脂乳、阿拉伯膠、谷氨酸鈉和淀粉等[20]。SALAR-BEHZADI等發(fā)現(xiàn)，以阿拉伯膠+明膠或果膠作為復(fù)合型保護(hù)劑時(shí)，可提高B.bifidumBB-12存活率[21]。因?yàn)榘⒗z+果膠可增強(qiáng)細(xì)胞膜中磷脂氫鍵穩(wěn)定性，明膠可在干燥后形成熱可逆凝膠膜，保護(hù)菌體免受高溫脫水傷害；SANTIVARANGKNA等研究發(fā)現(xiàn)，菊粉+果糖可增強(qiáng)B.bifidumBB-12耐熱性，并能抵御口服后胃液對(duì)益生菌定植的影響，但不宜過量，否則會(huì)因糖分過高造成干燥困難[22]；ANANTA等[5]研究了脫脂奶粉對(duì)益生菌LGG(標(biāo)準(zhǔn)株53103)噴霧干燥的保護(hù)作用，研究認(rèn)為，以復(fù)合保護(hù)劑低聚果糖+聚葡萄糖代替部分脫脂奶粉能提高益生菌存活率。張建峰等[23]研究了不同保護(hù)劑對(duì)益生菌釀酒活性干酵母活菌率的影響，研究發(fā)現(xiàn)，以20 g/L司班-60+20 g/LTween- 80作為保護(hù)劑時(shí)活菌率達(dá)77.89%，以50 g/L海藻糖+20 g/L司班-60+20 g/LTween-80作為生產(chǎn)用保護(hù)劑，活菌率可達(dá)(83.52±1.87)%。

2.4 益生菌菌體微膠囊化

將益生菌進(jìn)行微膠囊化能提高益生菌的細(xì)胞穩(wěn)定性和生產(chǎn)率[24]。IPAILIENé[25]認(rèn)為在微膠囊化過程中，益生菌存活率受微膠囊化方法、壁材、菌體類別、溫濕度、水分活度、pH、氧氣和壓力等諸多因素的影響，微膠囊的表面結(jié)構(gòu)對(duì)于益生菌的存活率也存在一定的影響。KAILASAPATHY等[24]認(rèn)為，微膠囊化能提高菌體的存活率，但在微膠囊化時(shí)，需考慮食品基質(zhì)對(duì)存活率的影響，此外，食品pH、食品基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)以及脂肪含量等對(duì)于增強(qiáng)菌體存活有重要影響。SHORI[26]將益生菌微膠囊化，可增強(qiáng)益生菌抗胃酸破壞能力，有利于益生菌在胃腸道的定植；SURONO等[27]研究認(rèn)為，微膠囊化能提高益生菌L.plantarumIS-10506的存活率；黃樂天等[28]研究了微膠囊化的蠟樣芽孢桿菌噴霧干燥工藝參數(shù)，在優(yōu)化條件下，存活率高達(dá)81%；李寧等[29]以明膠為壁材，優(yōu)化了雙歧桿菌(B.bifidusBBM)噴霧干燥工藝參數(shù)，優(yōu)化條件下微膠囊產(chǎn)率為65.7%，活菌存活率為53.5%，活菌數(shù)超過了1×1010CFU/g；譚文樂等[30]研究了醋酸菌噴霧干燥工藝，當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度為107.7 ℃、進(jìn)樣速度為11.09 mL/min、 壁材β-環(huán)糊精與阿拉伯膠之比為8.7∶1.3(質(zhì)量比)、 壁材質(zhì)量濃度為75.9 g/L時(shí)，醋酸菌存活率為23.1%， 醋酸菌的活菌數(shù)為3.8×109CFU/g；羅佳琦等[31]采用噴霧干燥技術(shù)將嗜酸乳桿菌制成微膠囊，通過正交實(shí)驗(yàn)得到最佳的處理?xiàng)l件，在進(jìn)風(fēng)溫度140 ℃，進(jìn)料速度14.58 mL/min時(shí)，以配比為1∶10(質(zhì)量比)的阿拉伯膠和麥芽環(huán)糊精為壁材，添加濃度為200 g/L條件下，嗜酸乳桿菌微膠囊活菌數(shù)達(dá)到了108CFU/mL，存活率達(dá)到了63%；BUSTAMANTE等[32]考察了植物黏液、麥芽糊精與可溶性蛋白質(zhì)作為微膠囊化壁材對(duì)B.infantis和L.plantarum噴霧干燥后菌體生存活性的影響，研究認(rèn)為，這2株益生菌在復(fù)合載體的保護(hù)作用下，保存期間生存率超過98%。

2.5 噴霧干燥工藝參數(shù)

2.5.1 出口溫度

噴霧干燥可分為恒定干燥和降速干燥2個(gè)連續(xù)的干燥階段，第一階段益生菌菌體含水量高，干燥過程對(duì)益生菌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷較少；第二階段菌體含水量較低(外高內(nèi)低)，益生菌微粒表面形成“玻璃體”，干燥速度變得十分緩慢，若噴霧干燥的出口溫度過高，將會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生熱脅迫，造成亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物大分子的損傷[33]。BOZA等研究了出口溫度對(duì)Beijerinckiasp.菌體存活的影響，研究發(fā)現(xiàn)降低出口溫度有利于減輕對(duì)菌體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，菌體存活率與出口溫度呈負(fù)相關(guān)[34]；郭云等[35]將發(fā)酵乳桿菌KLDS1.0709用脫脂牛奶作為基質(zhì)制備得到菌懸液，并添加不同比例的蔗糖與海藻糖研究噴霧干燥出口溫度對(duì)菌體存活的影響，結(jié)果表明，出口溫度的升高降低了菌體存活率，以100 g/L脫脂乳+50 g/L海藻糖+50 g/L蔗糖為基質(zhì)進(jìn)行噴霧干燥，菌體存活率高達(dá)73.90%；PARASTIWI等[36]為優(yōu)化噴霧干燥操作和提高干燥效率，研究了噴霧干燥出口溫度的自動(dòng)控制系統(tǒng)，以出口溫度作為評(píng)價(jià)參數(shù)與反饋控制變量，通過改變熱空氣流速或進(jìn)口溫度等方式間接調(diào)節(jié)益生菌菌懸液的濕度，通過微控制器可較好地實(shí)現(xiàn)噴霧干燥出口溫度的調(diào)節(jié)。

除了出口溫度外，進(jìn)料流速、氣流速度、物料濃度和干燥時(shí)間等對(duì)出口溫度有重要影響，但目前未發(fā)現(xiàn)有研究這些參數(shù)與出口溫度變化關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)告。對(duì)噴霧干燥過程參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化可減少菌體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生物大分子的損傷，提高益生菌菌體的存活率。值得注意的是，出口溫度不能過低，否則干燥不徹底，影響菌體的保存與菌體形貌。

2.5.2 噴霧壓力與離心盤轉(zhuǎn)速

壓力噴霧干燥法的噴霧壓力和離心噴霧干燥法的離心轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速對(duì)噴霧干燥有重要影響。對(duì)于壓力噴霧干燥來說，降低噴霧壓力，益生菌的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生物大分子損傷減少，能保持較高的存活率。RIVEROS等[37]研究了噴霧壓力對(duì)L.acidophilu益生菌存活率的影響。研究發(fā)現(xiàn)，噴霧壓力由100 kPa降低至50 kPa時(shí)，存活率可提高10%。主要原因是由于噴霧壓力降低，作用于益生菌菌體的剪切作用力減弱，從而對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷明顯降低；KIM等[38]和ZHOU等[39]也得到類似的研究結(jié)論。但需注意的是，噴霧壓力不能過小，否則益生菌菌懸液無法實(shí)現(xiàn)良好的霧化，從而形成菌團(tuán)，使干燥時(shí)間延長。對(duì)于離心噴霧干燥來說，霧化效果與離心盤轉(zhuǎn)速有直接關(guān)系，離心盤轉(zhuǎn)速快時(shí)，霧化效果較好。但值得注意的是，離心盤轉(zhuǎn)速過快容易對(duì)益生菌菌體產(chǎn)生極大的剪切作用力，在熱脅迫的協(xié)同作用下，對(duì)益生菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)生物大分子均可造成可逆或不可逆損傷，影響了菌體存活率。為平衡離心力與干燥效果的關(guān)系，?？刂齐x心轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速在3 000～20 000 r/min較為理想。離心轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速也不宜過低，否則霧化效果較差，易形成菌團(tuán)，干燥時(shí)間較長。

2.5.3 聯(lián)合其他干燥工藝

當(dāng)單獨(dú)采用噴霧干燥無法達(dá)到質(zhì)量要求時(shí)，可考慮與其他干燥工藝聯(lián)用，這樣可以適當(dāng)降低噴霧干燥的出口溫度，從而減少對(duì)益生菌菌體的熱脅迫和熱氧化損傷，提高菌體存活率。DONZ等[40]采用噴霧干燥與流化床聯(lián)用進(jìn)行菌體噴霧干燥(工藝過程如圖1)，結(jié)果表明，該工藝得到的菌體分散性較好。這種聯(lián)用干燥工藝比單純采用噴霧干燥效果要好，是目前應(yīng)用較為廣泛的益生菌干燥策略。

2.6 復(fù)水條件

益生菌菌粉使用之前需復(fù)水才能恢復(fù)其生物活性，復(fù)水條件對(duì)益生菌菌體存活率有重要影響，復(fù)水溫度是最為關(guān)鍵的參數(shù)，而復(fù)水介質(zhì)對(duì)益生菌菌體影響較少[41]。WANG等研究了L.bulgaricus的復(fù)水條件，發(fā)現(xiàn)復(fù)水溫度由4 ℃提升到50 ℃可明顯提高菌體存活率和益生菌數(shù)量；TEIXEIRA等[42]也得到類似的結(jié)論，復(fù)水溫度的提高，能提高S.thermophilus和B.longum活菌數(shù)。需注意的是，復(fù)水溫度不宜太高，否則會(huì)造成菌體生物大分子變性，影響菌體活菌數(shù)。

2.7 貯藏溫度、貯藏時(shí)間和包裝方式

菌體在低溫條件下可降低其生理活性，有利于菌種的保存，貯藏溫度對(duì)益生菌存活有重要影響[43]。MORGAN等[44]研究了抗氧化劑(VC和谷氨酸鈉)在低溫條件下對(duì)L.delbrueckiissp. Bulgaricus抗氧化的影響，結(jié)果表明，低溫條件下可減少細(xì)胞膜脂肪酸氧化和過氧化物產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)生物大分子，有利于菌體生物活性的保存[5]；益生菌存活率與貯藏時(shí)間也有一定的關(guān)系。通常情況下，隨著貯藏時(shí)間的延長，益生菌的存活率有不同程度的下降；益生菌包裝方式對(duì)存活率也有影響，采取隔絕氧氣保存(如充入惰性氣體N2或真空保存)能提高益生菌的存活率，特別是真空保存效果更佳。

3 提升益生菌噴霧干燥活菌率的優(yōu)化策略

為提升噴霧干燥后益生菌菌體存活率，可從以下3個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化：提升益生菌菌體熱耐受性，優(yōu)化噴霧干燥參數(shù)和使用保護(hù)性載體進(jìn)行保護(hù)。

3.1 誘導(dǎo)和預(yù)處理提升益生菌菌體熱耐受性

由于種屬的差異性或同種屬益生菌的生理差異，在相同噴霧干燥條件下常表現(xiàn)不同的耐受性并表現(xiàn)不同的存活率。如乳桿菌L.rhamnosus在相同噴霧干燥條件下，菌株GG比E800表現(xiàn)更強(qiáng)的熱耐受性[45]；雙歧桿菌屬的嬰兒雙歧桿菌B.infantis和長型雙歧桿菌B.longum在相同噴霧條件下也表現(xiàn)2倍差異的存活率[46]；HUANG等[47]用300 g/L甜乳清培養(yǎng)L.casei與P.freudenreichii并對(duì)耐受性相關(guān)成分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甜乳清既可作為培養(yǎng)基質(zhì)，還可起保護(hù)作用。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模和小試噴霧干燥過程中，菌體存活率可接近100%，對(duì)P.freudenreichii進(jìn)行耐受性分析發(fā)現(xiàn)，噴霧干燥過程中應(yīng)激蛋白呈現(xiàn)高水平表達(dá)，表現(xiàn)較好的熱耐受性；DIJKSTRA等[48]研究了溫度、pH、溶氧和鹽濃度等對(duì)L.lactis脅迫的影響，發(fā)現(xiàn)不同菌體熱脅迫和氧化脅迫有3個(gè)數(shù)量級(jí)區(qū)別?；蜣D(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，溶氧改變可誘導(dǎo)Met和Cys代謝相關(guān)基因的高通量表達(dá)[48]。

對(duì)菌體進(jìn)行亞致死劑量脅迫預(yù)處理可誘導(dǎo)菌體應(yīng)激蛋白的表達(dá)。DESMOND等[49]將L.paracasei于52 ℃預(yù)處理15 min后并將菌體于60 ℃熱處理，菌體存活率提高了300～700倍，噴霧干燥后菌體存活率提高了18倍；高滲透性預(yù)處理也可以提高菌體對(duì)脅迫的耐受性，并與熱脅迫有交叉保護(hù)的作用。需注意的是，對(duì)菌體進(jìn)行熱脅迫或滲透壓脅迫雖能提高菌體耐受性，但要注意熱脅迫時(shí)的溫度與滲透脅迫的滲透壓，否則可能造成益生菌菌體不可逆損傷；已進(jìn)行過熱預(yù)處理的菌株是否還能繼續(xù)進(jìn)行熱脅迫仍需深入研究，目前未見文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)脅迫機(jī)理研究目前也鮮有報(bào)道。開展菌體耐受性機(jī)制研究有利于更深入地了解噴霧干燥對(duì)菌體的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生物大分子的損傷，從而有利于優(yōu)化噴霧工藝并獲得高活性的益生菌菌體。

3.2 優(yōu)化噴霧干燥參數(shù)

研究噴霧干燥對(duì)菌體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生物大分子的影響，優(yōu)化噴霧干燥參數(shù)是益生菌噴霧干燥的重要研究內(nèi)容，也是正確設(shè)定噴霧干燥工藝參數(shù)的關(guān)鍵所在。噴嘴類型、進(jìn)口溫度、熱空氣流速、進(jìn)料液流量、出口溫度等對(duì)菌體存活率有重要影響。普遍認(rèn)為，噴霧干燥出口溫度過高對(duì)于保持菌體高存活率有負(fù)面影響[50]；出口溫度受進(jìn)口溫度、熱空氣流速、益生菌菌液的流速等綜合影響[38]。在保證益生菌干粉回收率的前提下，降低噴霧干燥出口溫度有利于提高菌體存活率；改變霧化液滴大小、空氣進(jìn)風(fēng)分布、進(jìn)料液流量等可降低出口溫度[4]。若菌體顆粒較大或水分含量過高，無法通過噴霧干燥達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可與其他干燥技術(shù)聯(lián)用，如先采用噴霧干燥形成顆粒，移除大部分水分，再通過流化床干燥移除殘存水分。ADOLFO等[51]采用噴霧干燥與流化床干燥聯(lián)用進(jìn)行了益生菌菌粉制備研究，結(jié)果表明，多級(jí)干燥可達(dá)到近100%的菌體存活率。

3.3 使用保護(hù)性載體

在噴霧干燥過程中，加入特定的載體可以實(shí)現(xiàn)對(duì)益生菌的保護(hù)，其保護(hù)機(jī)制有[4]：

(1)提高益生菌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和改善菌體耐受性[52]。包埋在保護(hù)載體內(nèi)的益生菌可減少脅迫對(duì)菌體的損傷。海藻糖就是常見的保護(hù)性載體。HERDEIRO等通過改變S.cerevisiae培養(yǎng)條件使細(xì)胞內(nèi)積累海藻糖，能提高存活率，因?yàn)楹Ｔ逄强稍跓崦{迫下保護(hù)酵母核糖體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，還能減少氧化脅迫造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化[53]；金屬陽離子(如Ca2+、Mg2+)能提高益生菌熱脅迫耐受性。ZHENG等[54]研究了Ca2+在乳糖與海藻糖保護(hù)劑存在的情況下對(duì)益生菌的保護(hù)機(jī)制。乳糖+Ca2+能極大改善益生菌熱耐受性。海藻糖+Ca2+得到相反結(jié)論，并認(rèn)為單純海藻糖能起到更好的保護(hù)作用；Mg2+也能起到良好的保護(hù)作用，因?yàn)镸g2+能較好地降低核糖體在噴霧干燥熱脅迫中的損傷，對(duì)菌體內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持有重要作用[12]。YANG[12]研究了Zn2+、Na+和Mg2+對(duì)益生菌L.rhamnosusGG,L.caseiZhang和L.plantarumP-8熱耐受性的影響，研究發(fā)現(xiàn)，10～50mmol/L濃度的Mg2+能提高乳酸菌株的熱耐受性，20 mmol/L的Mg2+能提高約100倍的L.rhamnosusGG存活率，且能縮短熱誘導(dǎo)期。

(2)使用保護(hù)載體。目前，主要應(yīng)用的保護(hù)載體為牛奶蛋白質(zhì)，主要是由于牛奶蛋白質(zhì)可在益生菌菌體表面形成保護(hù)膜，能“隔絕”外界不利因素對(duì)益生菌菌體的脅迫[48]。SONG等[55]在脫脂奶粉中加入Ca2+并采用熱處理使牛奶蛋白質(zhì)變性凝聚。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于未處理的脫脂奶粉，脫脂奶粉加入Ca2+并進(jìn)行熱凝聚可提高益生菌2個(gè)數(shù)量級(jí)的存活率；WANG等[56]也發(fā)現(xiàn)鈣凝聚牛奶作為干燥載體也具有優(yōu)秀的保護(hù)作用；KHEM等[57]發(fā)現(xiàn)分離乳清蛋白也可起到良好的保護(hù)作用，主要是由于蛋白質(zhì)分子與細(xì)胞表面疏水鍵結(jié)合形成保護(hù)層，可以緊密包埋益生菌菌體[54]。此外，也發(fā)現(xiàn)其他材料也可作為噴霧干燥的保護(hù)性載體，如酪蛋白酸鈉、甘油、明膠、氨基酸等也可作為菌體活性保護(hù)劑，但其抗熱保護(hù)效果目前研究較少。目前，幾乎所有微生物細(xì)胞干燥都添加了保護(hù)載體。保護(hù)劑可改變微生物干燥時(shí)的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止干燥或復(fù)水對(duì)細(xì)胞的損害，盡可能保持微生物原有的各種生理生化特性和生物活性。保護(hù)劑不僅影響益生菌存活率，還影響益生菌儲(chǔ)存期間的生產(chǎn)穩(wěn)定性。為提高益生菌的保護(hù)效果，常使用復(fù)合型保護(hù)載體。范娜等[58]選取海藻糖、明膠和甘油作為保護(hù)劑，研究其對(duì)嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌體的抗熱保護(hù)效果。結(jié)果表明，3種保護(hù)劑之間存在交互作用，復(fù)合使用時(shí)的抗熱保護(hù)效果比單獨(dú)使用時(shí)好，最佳復(fù)合配方為海藻糖160 g/L、甘油60 g/L、明膠1.4 g/L， 菌體存活率可達(dá)16.58%，活菌數(shù)為1.66×108CFU/mL。