油莎草總黃酮對牛奶貯藏保鮮作用的影響

翟紅月，王德萍，敬思群

1(新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊， 830046) 2(韶關學院 英東食品科學與工程學院，廣東 韶關，512005)

油莎草(CyperusesculentusL.)為莎草科莎草屬多年生草本植物，又被稱為油莎豆、人參豆、油莎果、地下板栗等[1]。油莎草原產(chǎn)于非洲地中海沿岸，在含沙60%以上的疏松砂質土壤里結果率可達90%以上，易于存活[2]。然而，人們對油莎草的開發(fā)利用多集中于油莎豆油，油莎草地上莖葉利用率較低，造成資源浪費。

油莎草總黃酮是油莎草長期自然選擇過程中的一類次生代謝產(chǎn)物。絕大多數(shù)黃酮類化合物具有很強的生物活性，可用于藥理研究，如抗氧化作用[3-5]、增強免疫調節(jié)作用[6]、降血脂作用[7-9]、抑菌作用[10-12]等。油莎草地上莖葉含有黃酮類物質，含量可達13.201 mg/g[13]，且具有很好的抗氧化活性[14]，可促進血液微循環(huán)，具有抗凝血作用[15]等。本研究優(yōu)化了油莎草總黃酮的純化工藝，探究油莎草總黃酮的抑菌性，并將其添加到牛乳中，以期為油莎草總黃酮作為天然防腐劑提供科學理論依據(jù)。這不僅提高了油莎草的附加值，也豐富了食品添加劑市場。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油莎草由新疆克拉瑪依匯利有限責任公司提供；油莎草總黃酮，實驗室自制(總黃酮提取率為1.46%[16])；蘆丁標準品(UV≥98%)，上海源葉生物技術有限公司；無水乙醇、NaOH等試劑均為分析純；鮮牛乳，市售。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Eshrichia.coil)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、青霉(Penicillium)、黑曲霉(Aspergillusnige)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)均由新疆大學生命科學與技術學院微生物實驗室提供。

1.2 儀器與設備

分光光度計(722S型)，上海安亭科學儀器廠；冷凍干燥機，德國SIGMA電儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)器(RE-52AA)，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的靜態(tài)吸附實驗

(1)吸附實驗。準確稱取預處理的大孔樹脂3.00 g，置于50 mL錐形瓶中，加入20 mL，3 mg/mL油莎草黃酮溶液，30 ℃、110 r/min振蕩，每隔2 h測定1次吸附量，并計算吸附率，總黃酮含量參考敬思群等[17]的方法進行測定。以時間為橫坐標，吸附率為縱坐標，繪制靜態(tài)吸附動力學曲線。

(1)

(2)

式中：Q，吸附量，mg/g干樹脂；C1，吸附前總黃酮溶液質量濃度，mg/mL；C2，吸附后溶液中總黃酮質量濃度，mg/mL；W，AB-8大孔樹脂質量，g；V，溶液體積，mL。

(2)解吸實驗。準確稱取上述已吸附油莎草總黃酮的飽和樹脂3.00 g，加入70%乙醇溶液15 mL，于30 ℃、110 r/min振蕩，每1 h測定1次解吸量，以時間為橫坐標，解吸率為縱坐標，繪制靜態(tài)解吸動力學曲線。

(3)

式中：Q，吸附量，mg/g干樹脂；C3，解吸后溶液中總黃酮質量濃度，mg/mL；V，解吸液體積，mL；W，樹脂質量，g。

1.3.2 AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的動態(tài)吸附實驗

(1)上樣質量濃度對AB-8大孔樹脂吸附性能的影響

稱取一定量的總黃酮凍干粉配成質量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL樣液溶液，各取250 mL在柱床體積為250 mL的AB-8大孔樹脂上進行上樣，吸附流速2 BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液無色，收集洗脫液，定容至500 mL，計算吸附率。

(2)進樣速度對AB-8大孔樹脂吸附性能的影響

取總黃酮質量濃度為1.0 mg/mL的樣品液250 mL過柱，流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0 BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液無色，收集洗脫液，定容至500 mL，計算吸附率。

(3)乙醇體積分數(shù)對AB-8大孔樹脂洗脫性能的影響

取黃酮質量濃度為1.0 mg/mL的樣品液250 mL過柱，吸附流速1BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液無色，再用4倍柱床體積的乙醇洗脫，乙醇體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%和90%，收集洗脫液，計算解吸率。

(4)洗脫速度對AB-8大孔樹脂洗脫性能的影響

取總黃酮質量濃度為1.0 mg/mL的樣品液250 mL過柱，吸附流速1.0 BV/h，吸附平衡后，用水洗至流出液無色，再用4倍體積的體積分數(shù)為70%的乙醇以0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，計算解吸率。

1.3.3 濾紙片法測定油莎草總黃酮的抑菌作用

預先活化供試菌株，并備好培養(yǎng)基平板，制備菌懸液。參考陳鳳清等[18]的方法將滅菌后的濾紙片分別浸入不同濃度的提取液和無菌水1～3 h。在無菌操作條件下，分別取0.2 mL各種菌懸液加入已制備好的培養(yǎng)基平板中，涂布均勻。用無菌鑷子取浸有提取液的濾紙片貼在含菌平板上，每個含菌平板貼2片，每組3個重復，并用浸有無菌水的濾紙片作對照。貼好濾紙片的平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，最后觀察總黃酮的抑菌效果，并測量抑菌圈直徑，結果取平均值。

1.3.4 油莎草總黃酮的最小抑菌濃度(MIC)的測定

按照程書朋等[19]的方法并稍作修改，在無菌操作條件下，把質量濃度為1 mg/mL的總黃酮母液分別稀釋成50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%的系列溶液。向平皿中分別加入不同質量濃度的總黃酮稀釋液各2 mL，然后加入不同供試菌懸液0.2 mL，倒入滅菌后的固體培養(yǎng)基(60 ℃左右)，充分混勻，待完全冷卻凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以菌落不生長的最低濃度為該黃酮對檢測菌的MIC。每個受試樣平行重復3次，以不含黃酮的瓊脂板作對照。

1.3.5 油莎草總黃酮對牛乳貯藏的影響

(1)油莎草總黃酮在牛乳中的抑菌效果

取100 mL的鮮牛乳2份，其中1份加入0.2 g油莎草總黃酮，另1份作為空白對照，室溫放置。每隔 24 h采用平板菌落計數(shù)法按照一定的稀釋梯度稀釋，并涂于固體培養(yǎng)基上，于(36±1)℃培養(yǎng)48 h，測出每板菌落數(shù)。

(2)油莎草總黃酮對牛乳酸度的影響

取300 mL的鮮牛乳6份，加入油莎草總黃酮配制成質量分數(shù)分別為0、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%和0.8%的溶液，室溫放置，每隔24 h采用NaOH滴定法測定1次牛乳酸度。

2 結果與分析

2.1 AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的靜態(tài)吸附及解吸動力學曲線

圖1 油莎草總黃酮在AB-8大孔樹脂上的吸附動力學曲線

Fig.1 Adsorption kinetics curve of total flavonoids on AB-8 macroporous resin

由圖1可知，AB-8型大孔吸附樹脂對油莎草總黃酮的吸附趨勢先快速增加，然后逐漸趨于平衡，靜態(tài)吸附起始階段吸附率較大，2 h后增加趨勢變緩，6 h后基本達到吸附平衡。AB-8型大孔吸附樹脂對油莎草總黃酮具有良好的吸附動力學特性，適合油莎草總黃酮的分離純化，這與李超等[20]利用AB-8型大孔吸附樹脂純化大葉金花草總黃酮得到的結果一致。

隨后，對上述吸附油莎草總黃酮達到飽和的AB-8大孔樹脂進行解吸。由圖2可知，靜態(tài)解吸起始階段解吸率不斷增大，隨著時間的延長曲線變得平緩，解吸率變化緩慢，4 h后達到解吸平衡。

圖2 油莎草總黃酮在AB-8大孔樹脂上的解吸動力學曲線

Fig.2 Desorption kinetics curve of total flavonoids on AB - 8 macroporous resin

2.2 AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的動態(tài)吸附實驗

2.2.1 上樣濃度對AB-8大孔樹脂吸附性能的影響

由圖3可以看出，隨著油莎草總黃酮質量濃度的增加，吸附率逐漸減小，低質量濃度有利于總黃酮的吸附，當總黃酮質量濃度為0.5～1.5 mg/mL時，吸附較為充分，吸附率均高于90%，綜合考慮時間等因素，選取1.0 mg/mL為最佳進樣質量濃度。

圖3 上樣質量濃度對AB-8大孔樹脂吸附性能的影響Figure 3 Effect of concentration of the original solution on adsorption properties of AB-8 macroporous resin

2.2.2 進樣速度對AB-8型大孔樹脂吸附性能的影響

由圖4可以看出，AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的吸附率隨著進樣速度的增加而急速減小，原因可能是流速加快之后導致總黃酮與樹脂的接觸時間變少，且容易導致進樣管的堵塞，使吸附率減小，這與孟憲軍等[21]研究AB-8大孔樹脂對藍莓花色苷的吸附結果一致，而當進樣速度為1.0 BV/h時，吸附率最高，故取1.0 BV/h為最適進樣速度。

圖4 不同進樣速度對AB-8大孔樹脂吸附性能的影響

Fig.4 Effect of flow velocity on adsorption properties of AB-8 macroporous resin

2.2.3 乙醇體積分數(shù)對AB-8大孔樹脂洗脫性能的影響

由圖5可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的解吸率先增加后減小，當乙醇體積分數(shù)為70%時，解吸率較高，乙醇體積分數(shù)大于 70%時，解吸率呈下降趨勢?？赡苁怯捎诓煌w積分數(shù)的乙醇極性大小不同[22]，而體積分數(shù)為70%乙醇的極性和油莎草總黃酮的極性更加接近，使其更容易洗脫下來，并且過高的乙醇體積分數(shù)，會降低提取出的總黃酮純度，因此選擇體積分數(shù)為70%的乙醇為最佳洗脫劑。

圖5 不同乙醇體積分數(shù)對AB-8型大孔樹脂洗脫性能的影響

Fig.5 8 Effect of the ethanol concention on desorption properties of AB-8 macroporous resin

2.2.4 洗脫速度對AB-8型大孔樹脂洗脫性能的影響

由圖6可以看出，AB-8大孔樹脂對油莎草總黃酮的解吸率隨著洗脫速度的增加而逐漸減小，當洗脫速度為0.5 BV/h時，解吸率較高，但由于洗脫速度過小導致耗時較長，且對洗脫劑的浪費較為嚴重；洗脫速度為2.5 BV/h時，解吸速率快，但解吸率最低；洗脫速度為1.5 BV/h時，解吸率較高，且沒有明顯拖尾現(xiàn)象，故選擇1.5 BV/h為最佳洗脫速度。

圖6 不同洗脫速度對AB-8大孔樹脂洗脫性能的影響

Fig.6 Effect of desorption velocity on desorption properties of AB-8 macroporous resin

2.3 油莎草總黃酮的抑菌作用

油莎草總黃酮的抑菌作用如表1所示，其對細菌有較好的抑制作用，尤其是革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，其中油莎草總黃酮對金黃色葡萄球菌的抑菌圈可達(13.3±0.3) mm；油莎草總黃酮對酵母菌有一定的抑制作用，抑菌圈直徑為(8.8±0.5) mm，但對黑曲霉和青霉的抑菌效果不明顯。

表1 油莎草總黃酮對試驗菌抑菌圈大小的影響 單位：mm

注：-表示無抑菌圈;+表示抑菌圈不明顯。

由表2可知，油莎草總黃酮的質量分數(shù)與抑菌效果成正相關，總黃酮質量分數(shù)越大，抑菌作用越強，這與魏珂等[23]研究苦瓜籽黃酮的抑菌效果一致。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC值均為 6.25%，大腸桿菌的MIC值為12.5%；與細菌相比，油莎草總黃酮對真菌抑菌效果不明顯，其中酵母菌的MIC值為25%，對霉菌的抑菌效果不明顯。

2.4 油莎草總黃酮對牛乳貯藏的影響

2.4.1 油莎草總黃酮對牛乳中微生物的抑制作用

由圖7可知，隨著時間的增加，牛乳中微生物的總菌數(shù)呈上升趨勢，常溫放置7 d后，添加了油莎草總黃酮的牛乳中菌落總數(shù)相比空白牛乳中的菌落總數(shù)減少了約60%，且隨著對試樣稀釋比例的增加，菌落總數(shù)急劇下降，初步表明添加油莎草總黃酮對牛乳中微生物的具有一定的抑制作用。

表2 油莎草總黃酮的MIC

注：-表示無菌生長；+表示有少量菌體生長；++表示有不超過 1/3平皿面積的菌落生長；+++表示有不超過1/2平皿面積的菌落生長；++++表示有超過1/2平皿面積的菌落生長。

圖7 牛乳中微生物的總菌數(shù)測定

Fig.7 Determination of total microorganism in milk

2.4.2 油莎草總黃酮對牛乳酸度的影響

總酸度是評價牛乳新鮮度的重要指標，牛乳擠出后，在存放過程中由于微生物的活動，分解乳糖產(chǎn)生乳酸，使牛乳總酸度升高。由圖8可知，添加油莎草總黃酮的鮮乳總酸度的變化相對較小，且隨著油莎草總黃酮添加量的增加，牛乳總酸度變化越小，這與項昭保等[24]研究野生橄欖黃酮對牛奶保鮮作用的結果一致。常溫放置7 d后，添加質量分數(shù)0.8%的油莎草總黃酮的牛乳總酸度相比空白鮮乳降低了50%，證實了其對牛乳中微生物的活動起到抑制作用，而且油莎草總黃酮的抑菌作用與其質量分數(shù)成正相關。因此，將油莎草總黃酮作為天然防腐劑應用于牛乳保鮮中具有一定的推廣意義，可以提高油莎草的經(jīng)濟價值。此外，油莎草總黃酮在牛乳保鮮中的最適添加量、溫度等條件還需進一步探討。

圖8 油莎草總黃酮對牛乳酸度的影響

Fig.8 Effect of total flavonoids on milk acidity

3 結論

AB-8大孔樹脂純化油莎草總黃酮的最佳工藝為進樣速度1.0 BV/h、進樣質量濃度1.0 mg/mL，洗脫劑最適宜體積分數(shù)70%、洗脫速度1.5 BV/h，在此條件下，總黃酮最高解吸率可達(94.72±1.21) %。純化后純度為(32.63±0.61) %，相比純化前提高了約3.5倍。油莎草總黃酮對細菌有較好的抑制作用，尤其對革蘭氏陽性菌抑制效果更佳，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌MIC值可達6.25%，對霉菌的抑菌效果不明顯。此外，添加油莎草總黃酮的鮮牛乳置于常溫7 d后，與空白鮮牛乳相比，其菌落總數(shù)減少了60%、牛乳總酸度降低了50%，且隨著油莎草總黃酮濃度的增加，牛乳酸度變化幅度越小。