基于美拉德反應制備的熟制黑枸杞加工工藝及活性成分變化規(guī)律

胡云峰，王曉彬，陳君然*，朱彥華

1(省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室(天津科技大學)，天津，300457) 2(早康枸杞股份有限公司，寧夏 中寧，755100)

熟制黑枸杞是一種將枸杞(LyciumbarbarumL.)在特定溫、濕度條件下加熱熟制后制成的黑色枸杞產(chǎn)品，是基于美拉德等一系列復雜反應后得到的，不同于天然黑果枸杞。美拉德反應(maillard reaction，MR)是氨基酸或蛋白質(zhì)中含有的氨基和糖類中的羰基在加熱條件下發(fā)生的復雜反應[1-2]，反應過程中會產(chǎn)生大量的中間產(chǎn)物(maillard reaction products，MRPs)，它們不僅可改善產(chǎn)品色澤、風味，還具有多種活性，如抗氧化、抑菌、抗炎等[3-4]。因此，美拉德反應廣泛存在并應用于中藥炮制過程中。中藥素有“生熟異治”的說法，經(jīng)炮制后的中藥化學成分發(fā)生變化，活性成分的增減導致其藥性改變，同時炮制也會賦予其特殊的“藥香”，緩和藥物氣味，這些成分的變化經(jīng)證明均是由MRPs帶來的[5-6]。

美拉德反應過程中會產(chǎn)生大量的呈色物質(zhì)，如類黑素等，使產(chǎn)品表現(xiàn)出良好的色澤[7]。同時，美拉德反應產(chǎn)生的復雜的雜環(huán)化合物賦予食品獨特的風味[8]。王旭等[9]研究表明，等量的葡萄糖和不同的氨基酸如Gly、Ala、Tyr、Asp、Val、His、Lys、Pro和Phe于180 ℃下反應可產(chǎn)生焦糖香氣、巧克力香氣和特殊的紫羅蘭香氣。除改善產(chǎn)品感官品質(zhì)外，李芳菲等[10]研究表明，MRPs具有強抗氧化性，能夠抑制脂肪氧化酸敗，保持肉糜鮮亮，延長肉糜保質(zhì)期。本試驗以枸杞為原料，基于美拉德反應制備熟制黑枸杞，并對其加工工藝及品質(zhì)變化規(guī)律進行相關研究，為枸杞的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍干枸杞：水分質(zhì)量分數(shù)為3%，寧夏中寧早康枸杞股份有限責任公司； PP聚丙烯托盤，天津愷瑞康科技有限公司，規(guī)格為25 cm×15 cm×2 cm。

無水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、沒食子酸、NaOH,均為分析純，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；苯酚(分析純)，天津市化學試劑三廠；福林酚(生化試劑)，上海索萊寶生物科技有限公司；蘆丁(生化試劑)，天津一方科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DL-101型電熱恒溫鼓風干燥箱，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；CR-10型自動測色色差計，柯盛行儀器有限公司；MP522型精密pH/電導率儀，成都銳新儀器儀表有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；PL203/01電子分析天平，特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 熟制黑枸杞制備工藝優(yōu)化

稱取一定量凍干枸杞，加入枸杞總質(zhì)量30%的蒸餾水后，均勻放置于托盤中，托盤用塑料膜封口后置于恒溫恒濕箱中，分別于50、60、70和80 ℃條件下熟化處理一定時間，即得到熟制黑枸杞，每隔4 h對MRPs反應程度和褐變度、pH值、色澤以及水分含量進行測定。

1.4 枸杞熟化過程中品質(zhì)變化規(guī)律研究

采用優(yōu)化的工藝，制備熟制黑枸杞，對熟制過程中的枸杞定期取樣，分析測定活性物質(zhì)的變化情況。

1.5 指標測定

1.5.1 MRPs反應程度和褐變度測定

采用比色法測定枸杞熟制過程中MRPs和褐變度[11]，每4 h取樣測定。取不同處理時間的熟制黑枸杞粉稀釋適當倍數(shù)，溶解、過濾、4 000 r/min離心15 min，測定其上清液在294、420 nm下的吸光度值。

1.5.2 色澤測定

參照賀帆等[12]的方法，用CR-10型自動測色色差計進行測定。每次隨機選取5顆枸杞，在每個枸杞果實的表面取相同位置的點測定亮度L*、紅綠度a*值和黃藍度b*值，結果取平均值。同時按照公式(1)計算枸杞的色差值ΔE。

(1)

式中：ΔE稱為色差值，是描述顏色與標準顏色間差異程度的指標；L*、a*、b*為標準顏色色度值。

1.5.3 水分測定

參照GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法。

1.5.4 pH值測定

取一定質(zhì)量枸杞按比例添加蒸餾水，溶解，使用MP522型精密pH/電導率測定儀測定pH值，每個樣品平行測定3次，取平均值。

1.5.5 枸杞活性物質(zhì)測定

參照付艷麗等[13]的苯酚-硫酸法測定枸杞多糖。枸杞中多酚的測定參照陳晨等[14]的紫外分光光度法。黃酮類化合物參照張穎等[15]的比色法進行測定。

1.5.6 感官評價

按照表1對熟制黑枸杞進行感官評價。

表1 感官評價標準

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 17.0 軟件的one-way ANOVA對重復性試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 熟制黑枸杞制備工藝優(yōu)化

2.1.1 不同溫度及處理時間對MRPs反應程度的影響

美拉德反應初級階段產(chǎn)生酮類及醛類等小分子化合物，這類化合物在294 nm處有特征吸收峰，因此294 nm的吸光值可反映美拉德反應所生成的MRPs的量，MRPs積累量能反映美拉德反應程度[16]。如圖1所示，各處理組在反應初期，吸光度值均劇烈升高，隨后開始趨于平緩。分析原因主要是反應初期，反應底物充分，迅速產(chǎn)生大量的中間產(chǎn)物(MRPs)，隨著反應底物逐漸被消耗，中間產(chǎn)物生成反應開始趨于停止。

由圖1可見，不同溫度對熟制黑枸杞美拉德反應進程的程度影響不同，加熱溫度為80 ℃時，美拉德反應在12 h已基本結束；而70 ℃時，結束時間為24 h左右，與80 ℃相比，美拉德反應時間延長了12 h。當熟化溫度為60 ℃時，美拉德反應達平穩(wěn)時間延長至48 h；50 ℃時反應結束時間約為68 h。說明溫度越高，反應速率越快，達到相同吸光度值的時間越短，說明美拉德反應越劇烈。

圖1 處理溫度對MRPs形成的影響

Fig.1 Effect of treatment temperature on content of intermediate products in MRPs

2.1.2 溫度及處理時間對MR褐變度的影響

在美拉德反應過程中，類黑精是末期產(chǎn)生的一類棕褐色高分子物質(zhì)，在一定范圍內(nèi)，反應時間越長，類黑精生成量越多，樣品顏色越深，褐變程度隨之加劇，420 nm處的吸光度值可以反映美拉德反應褐變程度[7]。從圖2中可以看出，80 ℃加工條件下，枸杞褐變度升高趨勢最為劇烈，褐變產(chǎn)物生成速度最快，50 ℃加工條件下褐變度升高趨勢最為平緩，褐變產(chǎn)物生成速度最慢，說明黑枸杞熟制過程中美拉德反應隨溫度的升高而加劇，溫度越高，美拉德反應越劇烈，褐變產(chǎn)物生成速度越快。

圖2 處理溫度對美拉德反應體系褐變度的影響

Fig.2 Effect of treatment temperature on content of endproducts in MRPs

2.1.3 溫度及處理時間對熟制黑枸杞pH值的影響

在熟制過程中，由于氨基酸的堿性基團氨基與還原糖的羰基進行縮合，使得游離的氨基基團數(shù)量下降，從而體系的pH值不斷下降，因此pH值下降的程度是衡量美拉德反應劇烈程度的一個指標。由圖3可知，體系pH值隨處理時間的延長而不斷降低，在處理初期，pH值下降速率較快，隨著處理時間的延長，pH值下降速率減緩。

圖3 處理溫度對枸杞pH值的影響

Fig.3 Effect of treatment temperature on the pH value of Lycium barbarum L.

80 ℃條件下處理12 h時，pH值已基本穩(wěn)定，達到4.74，而70 ℃條件下需處理24 h，隨著溫度的下降，達到相同pH值的處理時間增加，50 ℃條件下處理時間需延長至約64 h，是80 ℃條件下的5.3倍左右。隨著反應溫度的升高，反應產(chǎn)物的pH值降低速率明顯加快，說明反應進程隨溫度的升高而不斷加速，這與大量研究結果一致[26-27]。

2.1.4 溫度及處理時間對熟制黑枸杞色澤的影響

美拉德反應產(chǎn)物——類黑精是導致枸杞在干制處理過程中顏色由紅色變?yōu)楹谏闹饕镔|(zhì)，因此可以通過美拉德反應產(chǎn)物的色澤變化，定性判斷美拉德反應程度[19-20]。試驗以L*、a*值和ΔE分析反應程度，由圖4可見，不同溫度條件下枸杞的L*、a*值均隨著時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，ΔE隨著時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢。且溫度越高，變化趨勢越明顯。但在熟化處理后期，L*、a*值和ΔE變化趨于平緩，說明類黑精的生成速率趨近于0。

圖4 處理溫度對枸杞色澤的影響

Fig.4 Effect of treatment temperature on the color of Lycium barbarum L.

由各處理組的色差變化趨勢及變化幅度達到較大值的時間，可以推斷出一個有效的反應時間范圍，即 50 ℃，64 h；60 ℃，48 h；70 ℃，24 h；80 ℃，12 h。

2.1.5 溫度及處理時間對熟制黑枸杞水分含量的影響

枸杞屬高水分含量的漿果，在干制初期，過高的溫度會造成枸杞組織內(nèi)部氣體迅速膨脹，致使組織被壓破，發(fā)生開裂現(xiàn)象從而造成產(chǎn)品破損、營養(yǎng)物質(zhì)流失[30]。如圖5可知，枸杞水分含量隨處理時間的延長而不斷降低。80 ℃條件下枸杞水分含量一直處于較低水平，處理56 h后枸杞內(nèi)水分含量由32.74%下降到20.40%，下降了12%左右。

圖5 不同處理溫度對枸杞水分含量的影響

Fig.5 Effect of treatment temperature on the moisturecontent of Lycium barbarum L.

與80 ℃相比，枸杞在60和70 ℃條件下熟化處理時，水分含量略高，其中60 ℃干制條件下處理56 h后,水分含量下降到22.38%，已達到干制要求。50 ℃熟化處理時,枸杞水分含量處于較高水平。說明處理溫度對干制過程中枸杞水分含量變化有較大影響，處理溫度越高，枸杞的失水速率越快，達到干制要求所需時間越短。

2.1.6 溫度及處理時間對熟制黑枸杞感官品質(zhì)的影響

對不同干燥溫度下得到的熟制黑枸杞進行感官評價，結果如表2所示。不同溫度下，熟制黑枸杞感官品質(zhì)順序為：60 ℃>70 ℃>50 ℃>80 ℃。處理溫度過高時，熟制黑枸杞品質(zhì)相對較差，這是因為，過高的溫度經(jīng)美拉德反應制備的熟制黑枸杞苦焦味較重，且色澤不均一，與位錦錦的研究一致[22]。

表2 熟制黑枸杞的感官品質(zhì)

有研究表明，枸杞初期干燥溫度若高于70 ℃，鮮枸杞易爆裂，加工成的干制品易出現(xiàn)褪色現(xiàn)象，導致成品色澤不均勻[23]。溫度過低時，得到熟制黑枸杞的處理時間延長，能耗增加。因此選擇適當?shù)臏囟燃笆旎幚頃r間至關重要。60 ℃條件下美拉德反應賦予枸杞獨特的藥香味，使產(chǎn)品具有較好的質(zhì)地及口感。因此綜合熟制黑枸杞品質(zhì)和能耗問題，選擇60 ℃熟化效果較好，此時的熟化時間為48 h。

2.2 枸杞熟化過程中活性成分變化規(guī)律

2.2.1 枸杞熟化過程中多糖含量變化

枸杞多糖是一種水溶性多糖，隨美拉德反應時間的增加，枸杞多糖含量呈下降趨勢，這是因為美拉德反應是羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質(zhì))的反應，反應底物隨時間的延長而逐漸被消耗，導致枸杞多糖含量降低。處理前4 h，枸杞多糖含量下降迅速，由初始的23.75 mg/g下降到19.91 mg/g。4 h后，枸杞多糖含量降低速率減緩，處理至48 h時，枸杞多糖含量為6.01 mg/g，與初始相比，下降了3.95倍。

2.2.2 枸杞熟化過程中多酚含量變化

枸杞熟化過程中，加熱時間越長，枸杞的總酚含量積累越多。

圖6 枸杞熟化過程中多糖含量變化

Fig.6 The change of polysaccharide content of theLycium barbarum L. during ripening reaction注：不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05,下同。

由圖7可知，在整個處理過程中，處理前4 h，枸杞總酚含量上升速度較慢，由10.34 mgGAE/g上升到10.79 mgGAE/g，分析原因可能是在處理前期，枸杞內(nèi)的多酚氧化酶在60 ℃仍有部分活性，這與文獻報道一致，因此枸杞中的總酚部分被多酚氧化酶催化形成醌及其聚合物[24]。在處理4 h后，枸杞的多酚氧化酶活性大大降低，枸杞總酚含量上升速度加快，最終為22.94 mgGAE/g。

圖7 枸杞熟化過程中多酚含量變化

Fig.7 The change of polyphenols content of theLycium barbarum L. during ripening reaction

在60 ℃干制過程中，枸杞總酚含量呈現(xiàn)上升的趨勢，在這過程中可能會有部分多酚類物質(zhì)被破壞，但大部分多酚類物質(zhì)隨著干制過程的進行而積累。

2.2.3 枸杞熟化過程中黃酮含量變化

枸杞黃酮含量隨著處理時間的變化規(guī)律如圖8所示,枸杞黃酮含量在整個反應過程中隨著處理時間的延長而上升。在處理0 h時，枸杞黃酮含量僅為1.88 mgRE/g，24 h時黃酮含量為5.25 mgRE/g，處理至48 h時，枸杞黃酮含量上升至8.10 mgRE/g，為反應初始時黃酮含量的4.31倍。因此對枸杞進行熟制處理會使枸杞黃酮含量積累，這與李朋亮等的研究結論一致[34]。

圖8 枸杞熟化過程中黃酮含量變化

Fig.8 The change of flavonoids content of the Lyciumbarbarum L during ripening reaction

3 結論

確定了熟制黑枸杞的最佳熟化溫度和時間：60 ℃熟化48 h。此條件下制備出的熟制黑枸杞果肉較柔軟、厚實，味道酸甜，有獨特的藥香味，口感協(xié)調(diào)，顏色呈均一的黑色。最佳工藝下熟制黑枸杞內(nèi)枸杞多糖下降了3.95倍，但多酚類物質(zhì)與黃酮含量顯著升高，其中多酚類物質(zhì)在熟化48 h后，升高為熟化前的2.22倍；黃酮含量上升至8.10 mgRE/g，為反應初始黃酮含量的4.31倍。枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗輻射等作用，但是過量食用會引起上火現(xiàn)象，尤其對于體內(nèi)有炎癥或易腹瀉的人群不宜過多食用，實驗制備的熟制黑枸杞，雖枸杞多糖含量有所降低，但是多酚類物質(zhì)與黃酮含量顯著升高，提高了枸杞的抗氧化活性，一定程度上提高了枸杞的附加值。

4 討論

本研究基于美拉德反應制備熟制黑枸杞，將枸杞經(jīng)過高溫熟化使其充分發(fā)生美拉德反應，制備的熟制黑枸杞顏色為均一的黑色，味道酸甜，并具有獨特的藥香味。本試驗在枸杞熟制過程中枸杞多糖含量呈下降趨勢，這是因為美拉德反應是羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質(zhì))間的反應，反應底物隨時間的延長而逐漸被消耗，導致枸杞多糖含量降低。美拉德反應不僅賦予產(chǎn)品獨特的風味，而且在反應過程中物質(zhì)成分會發(fā)生變化。王桂欣[26]研究表明，棗粉在熱加工過程美拉德反應產(chǎn)生的類黑精、還原酮類物質(zhì)在脂質(zhì)氧化過程中作為電子供體打破自由基鏈式反應并減少氧化中間體，從而達到清除自由基的目的。陳善信等[27]比較了不同炮制品中黃酮的含量變化，結果表明，醋炒槐米和炒槐米均可使黃酮含量增加，炮制過程中，槐米中的一些有機質(zhì)被破壞而致蘆丁含量相對增加。崔春蘭等[28]研究表明，大蒜在美拉德反應過程中多酚和黃酮含量呈上升趨勢，這些活性物質(zhì)的增加也促進其抗氧化能力的增強。本試驗中制備的熟制黑枸杞內(nèi)枸杞多糖含量下降，但多酚類物質(zhì)與黃酮含量顯著升高，且隨著熟化時間的延長，枸杞內(nèi)類黑素的積累增加，對枸杞抗氧化活性的提高具有積極影響，與上述研究結果一致。