海藻糖合酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)

王希暉，劉洪玲，隋松森，楊少杰，王瑞明，王騰飛*

1(生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室(LBMP)(齊魯工業(yè)大學(xué))，山東 濟(jì)南，250353) 2(山東省微生物工程重點實驗室(齊魯工業(yè)大學(xué))，山東 濟(jì)南，250353) 3(諸城東曉生物科技有限公司，山東 濰坊，261000)

海藻糖[1]是由2個葡萄糖分子通過1,1-糖苷鍵結(jié)合而成的非還原性糖，因其特殊的生物學(xué)功能和獨特的應(yīng)用價值，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、農(nóng)牧業(yè)等行業(yè)，其發(fā)展前景非常廣闊，但生產(chǎn)上的不足導(dǎo)致其應(yīng)用受到一定程度的限制。當(dāng)前獲得認(rèn)可的海藻糖生產(chǎn)工藝是利用海藻糖合酶(trehalose synthase)[2]直接轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖，但海藻糖合酶的獲取受到限制，影響了海藻糖的生產(chǎn)。

因此，為實現(xiàn)海藻糖合成酶的安全高效表達(dá)，安全的宿主菌和高效的轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng)的選擇是關(guān)鍵?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)作為一種革蘭氏陽性菌[3]，由于其自身的非致病特性和分泌外源蛋白能力強(qiáng)的特性，以及有著長期制備發(fā)酵食品的歷史，已是公認(rèn)的一種安全菌株。因此本試驗采用B.subtilisWB800n進(jìn)行宿主表達(dá)，可解決宿主菌自身產(chǎn)內(nèi)毒素的不安全因素。枯草芽孢桿菌有多種不同的轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng)[4]，根據(jù)啟動子誘導(dǎo)機(jī)制的不同，可分為4種類型，分別是誘導(dǎo)型[5]、自誘導(dǎo)型[6]、時期特異型[7]和組成型[8]啟動子，由于誘導(dǎo)型啟動子是在發(fā)酵過程中添加化合物誘導(dǎo)或受環(huán)境變化來控制基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)酵條件受到限制，另外3種轉(zhuǎn)錄方式都是非誘導(dǎo)型，發(fā)酵過程簡便高效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

惡臭假單胞桿菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)、大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)、枯草芽孢桿菌WB800n (B.subtilisWB800n)菌株，質(zhì)粒是穿梭表達(dá)質(zhì)粒pHT01。

1.1.2 實驗試劑

pZERO-Blunt零背景平末端快速連接試劑盒、2×Phanta Max Master Mix、2×TaqPCR Master Mix：艾德萊生物科技有限公司；T4 DNA連接酶、限制內(nèi)切酶：Thermo公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、DNA純化回收試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 引物及核苷酸序列

引物通過Oligo 7.0軟件設(shè)計，由上海生工生物工程公司合成，其引物序列見表1。測序引物為T7啟動子的通用引物。

表1 質(zhì)粒構(gòu)建用引物

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，pH 7.0；

LB固體培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度20 g/L瓊脂粉;

TB培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g/L、酵母浸粉24 g/L、甘油4 mL/L、KH2PO417 mmol/L、K2HPO472 mmol/L;

優(yōu)化后TB培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g/L、酵母浸粉24 g/L、蔗糖12g/L、KH2PO46.5 mmol/L、K2HPO427 mmol/L;

GM增殖培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、山梨醇0.5 mol/L；

RM復(fù)蘇培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、山梨醇0.5 mol/L、甘露醇0.38 mol/L；

ETM電轉(zhuǎn)緩沖液：山梨醇0.5 mol/L、甘露醇0.5 mol/L、海藻糖0.5 mol/L、甘油體積分?jǐn)?shù)10%。

1.2 方法

1.2.1 穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1.1 PCR獲得目的基因片段

根據(jù)NCBI上報道的PsrfA和4個時期特異性啟動子PabrB、PspoVG、PLytR、PmmgA的基因序列人工合成PsrfA和PabrB-spoVG-LytR-mmgA的基因片段，并對啟動子PsrfA進(jìn)行了密碼子優(yōu)化[14]，將PsrfA啟動子的-35區(qū)(GTGATA)和-10區(qū)(TAAACT)分別改為-35區(qū)(TTGACT)和-10區(qū)(TATAAT)。

1.2.1.2 pHT01-PsrfA- treS表達(dá)載體的構(gòu)建

以人工合成的PsrfA基因序列為模板，用引物SrfA-F/SrfA-R通過PCR擴(kuò)增得到長度為606 bp的PsrfA基因片段，以惡臭假單胞桿菌KT2440基因組為模板，用引物TreS-1-F/TreS-R經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到長度為2 067 bp的treS基因片段，再通過重疊PCR的方法將2個片段擴(kuò)增連接得到長度為2 673 bp的帶有His標(biāo)簽的PsrfA-treS基因片段。將片段連接到pZERO-Blunt平末端載體，送測序公司進(jìn)行基因測序，測序正確后，采用限制性內(nèi)切酶BamH I/AatII對pZERO-PsrfA-treS和pHT01雙酶切，再用T4連接酶連接得到pHT01-PsrfA-treS重組載體。載體構(gòu)建流程如圖1所示。

圖1 PHT01-PsrfA-TreS質(zhì)粒載體的構(gòu)建

Fig.1 Construction of pHT01-PsrfA-treS plasmid vector

1.2.1.3 pHT01-P43-treS表達(dá)載體的構(gòu)建

以枯草芽孢桿菌基因組為模板，用引物P43-F/P43-TreS-R PCR擴(kuò)增得到長度445 bp的P43基因片段，在treS基因315 bp處有酶切位點NotI，以構(gòu)建的pHT01-PsrfA-treS為模板，用引物TreS-P43-F/TreS-1-R PCR擴(kuò)增得到長度為315 bp的treS-1基因片段，再通過重疊PCR的方法將2個片段連接擴(kuò)增得到長度為760 bp的P43-treS-1基因片段。將片段連接到pZERO-Blunt平末端載體送到測序公司進(jìn)行基因測序，測序正確后，用限制性內(nèi)切酶BamH I/NotI對pZERO-P43-treS-1和pHT01-PsrfA-treS進(jìn)行雙酶切，再用T4連接酶連接得到pHT01-P43-treS重組載體。

1.2.1.4 pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS表達(dá)載體的構(gòu)建

依據(jù)NCBI中公布的啟動子序列，對PabrB-spoVG-LytR-mmgA基因序列進(jìn)行人工合成后，用引物PabrB-F/PmmgA-TreS-R PCR擴(kuò)增得到長度1 200 bp的PabrB-spoVG-LytR-mmgA基因片段，在treS基因315 bp處有酶切位點NotI，以構(gòu)建的pHT01-PsrfA- treS為模板，用引物TreS-mmgA-F/TreS-1-R PCR擴(kuò)增得到長度為315 bp的treS-1基因片段，再通過重疊PCR的方法將2個片段連接擴(kuò)增得到長度為1 515 bp的PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS-1基因片段。將片段連接到pZERO-Blunt平末端載體送到測序公司進(jìn)行基因測序，測序正確后，限制性內(nèi)切酶BamH I/NotI對pZERO-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS-1和載體pHT01-PsrfA-treS進(jìn)行雙酶切，再用T4連接酶連接得到pHT01- PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS重組載體。

1.2.2 產(chǎn)海藻糖合酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

1.2.2.1 枯草芽孢桿菌感受態(tài)的制備

挑取新鮮的LB固體培養(yǎng)基(添加新霉素抗性)表面的B.subtilisWB800n單菌落，接種于5 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜；取500 μL上述菌液轉(zhuǎn)接到50 mL GM增殖培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=1.0；將菌液轉(zhuǎn)移至已滅過菌的100 mL離心管，冰水浴10 min后，5 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體；用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液ETM洗滌3～4次，將洗滌后的菌體重懸于500 μL的ETM中，即為枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞[15]；將制備好的感受態(tài)細(xì)胞分裝為每管60 μL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 構(gòu)建重組菌B.subtilisWB800n(pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS)

從-80 ℃冰箱取出3管60 μL的感受態(tài)細(xì)胞(新制備可直接用，不需要放置冰箱)，分別加入6 μL的質(zhì)粒pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS混合均勻，預(yù)冷5 min后將混合的菌液加入2 mm的電轉(zhuǎn)杯(電轉(zhuǎn)杯需要提前處理：無水乙醇浸泡10 min，然后用吹風(fēng)機(jī)吹干，置于無菌操作臺紫外照射20 min，然后蓋上蓋子，放置冰中預(yù)冷)中，用Eppendorf電轉(zhuǎn)儀在2 000 V、5 ms條件下電擊1次。電轉(zhuǎn)完畢后，迅速加入1 mL RM復(fù)蘇培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min復(fù)蘇4 h后，離心重懸后涂布在含氯霉素(40 μg/mL)固體LB培養(yǎng)基，放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1～2 d，篩選抗氯霉素的菌株。

1.2.2.3 驗證重組菌

挑取上述抗氯霉素菌株的單菌落作為模板，分別通過上下游引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證，最終獲得陽性克隆菌株。

1.3 搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

(1)碳源優(yōu)化。分別以可溶性淀粉、麩皮、葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖、蔗糖為碳源，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，TB培養(yǎng)基做對照。

(2)碳氮比優(yōu)化。胰蛋白胨與酵母浸粉的比例分別選擇0∶36、6∶30、12∶24、18∶18、24∶12、30∶6、36∶0，碳源使用優(yōu)化后的蔗糖，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，TB培養(yǎng)基做對照。

(3)不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響。使用優(yōu)化碳源和氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，溫度分別設(shè)置30、33、37、40和45 ℃，驗證發(fā)酵溫度對酶活的影響。

(4)培養(yǎng)基初始pH值優(yōu)化。以優(yōu)化后的TB培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，改變培養(yǎng)基中K2HPO4和KH2PO4的比例，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

1.4 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

使用總體積為5 L發(fā)酵罐(BLBIO-5GJ)[16]，工作體積為3 L，發(fā)酵過程中，溫度維持37 ℃，pH值維持在8.0，(pH值通過滴加10%的氨水來維持)，并且通過對通風(fēng)量與攪拌速率的控制使溶氧(dissolved oxygen,DO)維持在20%～40%。初始培養(yǎng)基為優(yōu)化后的TB培養(yǎng)基，另加入40 μg/mL的氯霉素。發(fā)酵時間32 h，每隔10、13、16、20、24、28、32 h取樣1次，直至發(fā)酵結(jié)束。

1.4.1 酶活測定

將在不同發(fā)酵時間取出的40 mL菌樣于8 000 r/min離心10 min，棄去上清得到沉淀，用配制好的10 mmol/L pH 8.0 PBS緩沖液重懸，經(jīng)超聲波破碎得到粗酶液。取5 mL粗酶液與5 mL 60%的麥芽糖溶液混勻，在25 ℃水浴鍋中轉(zhuǎn)化4 h后,于100 ℃煮沸10 min，滅活，通過液相色譜分析儀測定其轉(zhuǎn)化的海藻糖含量，并計算出不同發(fā)酵時間的每克菌體的酶活。

酶活力單位[17]定義：在酶的最佳酶反應(yīng)條件下(25 ℃，pH 8.0)，將質(zhì)量濃度300 g/L麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，每小時產(chǎn)生1 μmol海藻糖所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

1.4.2 SDS-PAGE檢測分析

取不同培養(yǎng)條件的發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，棄去上清，用0.05 mol/L pH 8.0的PBS緩沖液重懸，超聲破碎，加入SDS-PAGE樣品緩沖液后煮沸10 min，樣品進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%)。電泳結(jié)束后凝膠染色4 h然后脫色，將脫色后的凝膠用凝膠成像系統(tǒng)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS的構(gòu)建

通過PCR和重疊PCR技術(shù)得到PsrfA-TreS、P43-TreS-1和PabrB-spoVG-LytR-mmgA-TreS-1基因片段，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，在2 700、750和1 500 bp左右出現(xiàn)特異性電泳條帶，如圖2-a、b、c所示，與理論值2 673、760、和1 515 bp相符，表明獲得了PsrfA-TreS、P43-TreS-1和PabrB-spoVG-LytR-mmgA-TreS-1基因片段。將制得的片段連接到表達(dá)載體pHT01相應(yīng)酶切位點，重組載體pHT01-PsrfA-TreS通過限制性內(nèi)切酶BamH I/AatII對載體進(jìn)行酶切驗證，載體pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS通過限制性內(nèi)切酶BamH I/NotI對載體進(jìn)行酶切驗證，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，在2 700、750和1 500 bp左右出現(xiàn)特異性電泳條帶，如圖2-d、e、f所示，表明表達(dá)載體pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS構(gòu)建成功。

a：M-Maker DL5000；1-PsrfAband；2-treS band；3-PsrfA-treS band;b：M-Maker DL5000；1-P43band；2-treS-1 band；3-P43-treS-1 band;c：M-Maker DL5000；1-PabrB-spoVG-LytR-mmgAband；2-treS-1 band；3-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS-1 band;d：M-Maker DL5000; 1-Double enzyme digestion of pHT01-PsrfA-treS; 2-pHT01-PsrfA-treS;e：M-Maker DL5000; 1-Double enzyme digestion of pHT01-P43-treS; 2-pHT01-PsrfA-treS;f：M-Maker DL5000; 1-Double enzyme digestion of pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS; 2-pHT01- PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS圖2 基因的PCR擴(kuò)增電泳圖和重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切驗證圖

Fig.2 PCR amplified electrophoresis and restrictionenzyme digestion identifieation of recombinant plasmid

2.1.2 重組菌B.subtilisWB800n/pHT01-PsrfA-treS、B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS和B.subtilisWB800n/pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS的構(gòu)建

提取質(zhì)粒pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS，并用核酸超微量分光光度計(BioFuture MD2000)測DNA質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示，DNA質(zhì)量濃度為220 ng/μL左右。將6 μL提取的質(zhì)粒與60 μLB.subtilisWB800n感受態(tài)細(xì)胞[18]混合并進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，分別使用上下游引物SrfA-F/TreS-1-R、P43-F/TreS-1-R和PabrB-F/TreS-1-R對陽性克隆子進(jìn)行PCR驗證，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，在1 000、750和1 500 bp左右出現(xiàn)特異性電泳條帶，如圖3-a、b、c所示，與理論值921、760、和1 515 bp相符，表明質(zhì)粒載體pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS成功轉(zhuǎn)化到B.subtilisWB800n中，并獲得了陽性克隆菌株。

a: M-Maker AL5000;1-positive control plasmid pHT01-PsrfA-treS; 2-negative control B.subtilis WB800n; 3～8-PsrfA-treS-1 fragment electrophoretic diagram;b: M-Maker AL5000;1-positive control plasmid pHT01-P43-treS; 2-negative control B.subtilis WB800n; 3～8-P43-treS-1 fragment electrophoretic diagram;c: M-Maker AL5000;1-positive control plasmid pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS; 2-negative control B.subtilis WB800n; 3～8-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS-1 fragment electrophoretic diagram圖3 重組菌的菌落PCR驗證圖

Fig.3 Colony PCR validation of recombinant bacterial

2.2 啟動子的篩選

將構(gòu)建成功的重組菌枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800n/pHT01-PsrfA-treS、B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS和B.subtilisWB800n/pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS分別接種到LB培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)分析不同啟動子重組菌的單位菌體酶活，結(jié)果如圖4所示，3個重組菌均能在胞內(nèi)表達(dá)海藻糖合酶，而且隨著發(fā)酵時間的延長，單位菌體酶活呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。發(fā)酵過程中組成型啟動子P43啟動子表現(xiàn)出較高的酶活，其次是4個時期特異性串聯(lián)啟動子PabrB-spoVG-LytR-mmgA，最后是PsrfA啟動子。P43啟動子表達(dá)的酶活最高達(dá)到約2 167 U/g，這說明P43啟動子的啟動強(qiáng)度最大，較不同時期特異性啟動子串聯(lián)特性強(qiáng)，而PsrfA啟動子是群體密度依賴型啟動子[19]，其表達(dá)酶活的時間延遲，這主要是因為在密度低時，啟動子的啟動強(qiáng)度受到限制。

圖4 胞內(nèi)表達(dá)TreS重組菌LB培養(yǎng)基酶活

Fig.4 Intracellular TreS enzyme activity of recombinant bacteria in LB medium

為了進(jìn)一步驗證3個啟動子的酶活特性,將3個重組菌接種至更利于外源酶表達(dá)的TB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。菌體表達(dá)的總酶活均有明顯增加，P43調(diào)控的重組菌最高酶活達(dá)到3 481 U/g，但3個啟動子的表達(dá)酶活依然遵循LB培養(yǎng)基相同的情況，亦在發(fā)酵的后期，酶活下降迅速，這主要由2個原因造成，一是后期菌體為了維持生長，對表達(dá)的外源酶進(jìn)行降解；二是發(fā)酵后期，因為營養(yǎng)的逐漸匱乏，多數(shù)菌體產(chǎn)生芽孢，造成酶的降解。

圖5 胞內(nèi)表達(dá)TreS重組菌TB培養(yǎng)基酶活

Fig.5 Intracellular TreS enzyme activity of recombinant bacteria in TB medium

2.3 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 碳源優(yōu)化

以TB培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基[20]，改變TB培養(yǎng)基中的碳源組分，將重組菌B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS在500 mL含有100 mL不同碳源的TB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵酶活分析。在37 ℃，200 r/min下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h。分析不同碳源對發(fā)酵酶活的影響，從圖6、圖7可以看出，不同碳源對發(fā)酵酶活有不同的影響，以蔗糖為碳源時酶活達(dá)到5 763 U/g，明顯高于其他碳源。對蔗糖的添加量進(jìn)行了優(yōu)化，最終得出，添加12 g/L蔗糖酶活最高。

圖6 B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS的不同碳源比較

Fig.6 Different carbon source comparison of B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS

圖7 B.subtilis WB800n/pHT01-P43- treS的不同蔗糖質(zhì)量濃度比較

Fig.7 Different sucrose concentration comparison of B.subtilis WB800n/pHT01-P43- treS

2.3.2 氮源優(yōu)化

氮源是微生物生長的必要元素，同時在發(fā)酵過程中也是增加成本的因素之一[21]，因此，有必要分析氮源對發(fā)酵酶活的影響。在上述優(yōu)化后的TB培養(yǎng)基中，改變其中的胰蛋白胨與酵母浸粉的比例，在37 ℃，200 r/min下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h，驗證不同比例的2種氮源對發(fā)酵液酶活的影響，如圖8所示，原有的胰蛋白胨∶酵母浸粉比例為12∶24時對酶活的影響具有明顯的優(yōu)勢，因此維持原有的比例成分不變。

圖8 B.subtilis WB800n/pHT01-P43- treS的不同氮源比例的比較

Fig.8 Different nitrogen sources ratio comparison of B.subtilis WB800n/pHT01-P43- treS

2.3.3 發(fā)酵溫度對酶活的影響

對原始TB培養(yǎng)基的主要成分進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化后，進(jìn)一步分析發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響。重組菌先在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)8 h，然后改變培養(yǎng)溫度。從圖9可以看出，37 ℃為最佳溫度，溫度過高過低都不利于海藻糖合酶的表達(dá)。

圖9 B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS的發(fā)酵溫度的比較

Fig.9 Different fermentation temperatures comparison of B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS

2.3.4 發(fā)酵pH值對產(chǎn)酶的影響

對培養(yǎng)基的主要成分進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化后，進(jìn)一步分析不同發(fā)酵pH值對產(chǎn)酶的影響，以不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在37 ℃，200 r/min下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液酶活如圖10所示。

圖10 B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS的發(fā)酵pH值的比較

Fig.10 Different fermentation pH comparison of B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS

結(jié)果表明,在pH 7.0～8.0總酶活相對較高，pH 8.0時，總酶活最高，且此時的菌體干重亦有明顯優(yōu)勢。

2.4 發(fā)酵罐放大發(fā)酵培養(yǎng)

為進(jìn)一步探討產(chǎn)酶穩(wěn)定性，將重組菌B.subtilisWB800n/pHT01-PsrfA-treS、B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS和B.subtilisWB800n/pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS在裝有優(yōu)化后TB培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵驗證，發(fā)酵罐總裝液量為3 L，轉(zhuǎn)速500 r/min，通風(fēng)量0.3 vvm，溫度37 ℃，初始pH值7.0，發(fā)酵前8 h發(fā)酵液pH值緩慢上升至8.0，之后通過滴加NaOH維持pH值穩(wěn)定在8.0。發(fā)酵結(jié)果如圖11所示，結(jié)果表明，TreS的表達(dá)量仍然是P43>PabrB-spoVG-LytR-mmgA>PsrfA。

圖11 胞內(nèi)表達(dá)TreS重組菌的5 L發(fā)酵罐酶活

Fig.11 Enzyme activity of recombinant bacteria in 5 L fermentor

2.5 SDS -PAGE凝膠分析

不同發(fā)酵時間取出的樣品經(jīng)超聲破碎后做蛋白電泳，由圖12可以明顯看出，在75 kDa處有明顯的條帶，與海藻糖合酶75.634 kDa理論值[22]相符，說明海藻糖合酶基因在重組菌中成功表達(dá)。

M-Marker;1-B.subtilis WB800n;2～9-10,13,16,20,24,28,32 h圖12 B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS在5 L發(fā)酵罐中菌體破碎液SDS-PAGE分析

Fig.12 SDS-PAGE analysis of B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS in 5 L fermentor

3 結(jié)論

本研究基于海藻糖合成酶在生產(chǎn)上的不足導(dǎo)致其應(yīng)用受到一定程度的限制，本試驗通過基因改造的手段，利用枯草芽孢桿菌的非誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了海藻糖合成酶在安全菌株枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)系統(tǒng)[23]。本研究分別將單啟動子和多啟動子與海藻糖合成酶基因融合后構(gòu)建到大腸-枯草穿梭質(zhì)粒pHT01[24]上，通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，得到了重組菌B.subtilisWB800n/pHT01-PsrfA-treS、B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS和B.subtilisWB800n/pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS。通過利用基礎(chǔ)LB、TB培養(yǎng)基初步驗證重組菌的酶活，驗證3種啟動子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，篩選得到強(qiáng)度最高的啟動子P43，得到高效表達(dá)海藻糖合酶的重組菌B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS，并對此重組菌進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，進(jìn)一步提高了海藻糖合酶的表達(dá)量，成功構(gòu)建了自誘導(dǎo)表達(dá)海藻糖合成酶的安全高效表達(dá)系統(tǒng)，為后續(xù)制備食品級的酶制劑[25]奠定了基礎(chǔ)。