擬指數—DO-stat兩階段補料策略在糖蜜酵母高密度培養(yǎng)中的應用

徐富增，王柯，李善元，毛忠貴，張建華*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(云南保山九隆酵母有限公司，云南 保山，678000)

酵母及其副產品可廣泛地應用于食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)，有著廣闊的應用市場和良好的經濟效益。2016年全球酵母產品市場達到近71億美元，預計到2022年將達到107億美元[1]。酵母生產原材料的廉價易得是酵母產品經濟效益好的一個原因。糖蜜作為制糖加工的副產物，是最廉價的碳水化合物之一，含有大約50%的糖類，以及一些含氮物質、維生素和微量元素，是用于酵母培養(yǎng)的主要原料[2-4]。

在酵母培養(yǎng)過程中出現的Crabtree效應[5]是制約酵母生長的一個因素，該效應指當可發(fā)酵性碳源濃度過高時，即使供氧充足，也會導致碳源流向乙醇合成途徑，導致乙醇積累，使得糖利用率下降。而且，高濃度的乙醇副產物也會對細胞結構及功能造成損傷，抑制菌體生長和產物合成[6]。因此，酵母培養(yǎng)難點主要在于如何有效控制糖濃度，在保證酵母正常生長的同時減小溢流代謝，提高原料利用率，實現酵母的高得率、高濃度生長[7]。

高密度培養(yǎng)是酵母工業(yè)的發(fā)展趨勢，實現高密度、高產率和高濃度培養(yǎng)是酵母工業(yè)的目標和方向[8-9]。在補料分批過程中可以通過補料策略的優(yōu)化，控制培養(yǎng)基營養(yǎng)的流入，實現生物量和得率最大化。近年來，隨著研究的不斷深入，補料策略逐漸變得復雜化，引入一些更為復雜的數學模型及人工智能技術。

張許等[10]將差分進化算法(differential evolution，DE)與傳統(tǒng)比例-積分-微分(proportional-integral-derivative，PID)控制策略相結合，構建了用于釀酒酵母分批補料培養(yǎng)過程的在線自適應控制策略，成功將乙醇穩(wěn)定地控制在設定值(1 g/L)附近，同時使得酵母增殖質量濃度達到34.45 g/L。CHOPDA等[11]采用基于TCP/IP協(xié)議的解耦輸入-輸出線性化控制器(decoupled input-output linearizing controller，DIOLC)實時在線控制溶氧和殘余葡萄糖，實現酵母生長最大化，與PID或PID-控制器相比，可提高23%和18%的菌體量。HOCALAR等[12]基于狀態(tài)估計算法構建了狀態(tài)反饋線性控制策略，通過在控制算法中設定菌體濃度和乙醇濃度，通過調節(jié)最小乙醇濃度來控制比生長速率，調整流加策略，成功實時控制乙醇濃度，以使生物質生產率最大化。但是，對于多數中小型酵母生產企業(yè)來講，這些方法并不適用，因為先進的方法往往涉及復雜的控制設備和實施復雜控制算法，需要必要的輔助設備，這些額外且昂貴的經濟投入是大多數中小型企業(yè)現代化道路上的一個嚴重障礙[13]。因此，開發(fā)一種簡單、低成本的方法進行釀酒酵母培養(yǎng)，更適用于小企業(yè)的需要。

本文以實驗室優(yōu)化的糖蜜培養(yǎng)基為基礎，以菌體量、菌體得率和生產強度為評價指標，探究了DO-Stat和擬指數2種常規(guī)補料策略，在此基礎上開發(fā)了“擬指數—DO-Stat”兩階段補料策略，該策略可以盡可能解除Crabtree效應，避免溢流代謝，提高酵母菌體得率和生產強度，提高設備利用率，為酵母工業(yè)高密度培養(yǎng)工藝的開發(fā)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，由云南保山九隆酵母有限公司提供。于斜面保藏培養(yǎng)基4 ℃保藏。

1.2 培養(yǎng)基

(1)種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖22.0，酵母抽提物8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，無水CaCl20.06，pH自然，115 ℃滅菌15 min。

(2)斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖22.0，酵母提取物8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，無水CaCl20.06，瓊脂2.0。pH自然，115 ℃滅菌15 min。

(3)上罐培養(yǎng)基(g/L)：糖蜜稀釋液總糖79.0，(NH4)2SO48.56，KH2PO41.85，MnCl2·4H2O 0.003，ZnSO4·7H2O 0.007 5。

(4)補料培養(yǎng)基(g/L)：糖蜜稀釋液總糖350，(NH4)2SO438，KH2PO48.16。培養(yǎng)基為保證碳源總量一致，均按總糖計稱取相應質量的糖蜜。

1.3 試劑與材料

葡萄糖、NH4Cl、MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O等(分析純)，上海國藥集團；酵母抽提物(分析純)，英國Oxoid公司；甜菜糖蜜，云南保山九隆酵母有限公司，經稀釋后配料使用，主要成分如表1所示。

表1 糖蜜主要成分 單位：%(質量分數)

1.4 儀器與設備

5 L二聯(lián)發(fā)酵罐(BLBIO-5GJ-2)，上海百倫生物設備有限公司；高效液相(U-3000)，USA Dionex；立式壓力蒸汽滅菌器(LS-B50L)，上?；瘜W醫(yī)用核子儀器公司；分析天平(AB204-N)，瑞士梅特勒公司；真空干燥箱(DZF-6050)，上海博訊實業(yè)有限公司；回轉式恒溫搖床(HYG-Ⅱ)，上海欣蕊自動化設備有限公司；電子天平(BS1100+)，上海友聲衡器有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-1FD)，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.5 種子培養(yǎng)

從斜面培養(yǎng)基中挑取1～2環(huán)酵母菌，接種于種子培養(yǎng)基，500 mL三角瓶裝液量為200 mL，于200 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)16～17 h，至酵母數為3×108～4×108個/mL。

1.6 酵母培養(yǎng)方式

酵母高密度培養(yǎng)采取先分批后流加的方式。先將種子培養(yǎng)基按體積分數為10%的接種量接種于上罐培養(yǎng)基，待可發(fā)酵性糖和乙醇消耗完畢，溶氧(dissolved oxygen，DO)上升開始流加。本文所探究的補料方式共有3種，分別為擬指數補料、DO-Stat補料、兩階段補料。不同的補料方式均流加相同的體積。

(1)分批培養(yǎng)：在5 L機械攪拌式通風發(fā)酵罐中裝入2.7 L上罐培養(yǎng)基，接入300 mL種子培養(yǎng)基。調整通氣量為5.0 L/min，初始轉速400 r/min。在酵母達到對數生長的3～4 h之后，將轉速調整到600 r/min。利用2 mol/L的H2SO4和2 mol/L的NaOH維持pH值為5.5，溫度30 ℃，食品消泡劑控制泡沫產生。

(2)擬指數補料：采用上罐培養(yǎng)基進行分批培養(yǎng)，在21 h左右溶氧上升，即可發(fā)酵性糖和乙醇消耗完畢后，開啟補料泵，按照預設的補料速率將補料培養(yǎng)基流加入罐內。開始補料后，調整通氣流量為7.0 L/min，轉速600～900 r/min，溶氧關聯(lián)攪拌控制DO不低于30%。pH值、溫度、泡沫控制與分批培養(yǎng)相同。

補料速率按公式(1)[14]計算：

(1)

其中：F，補料速率，L/h；μ，所設定的酵母比生長速率，h-1；V0，補料開始罐內培養(yǎng)基體積，L；ρC0，開始補料時罐內菌體質量濃度，g/L；YX/S，菌體得率，%；ρSF，補料培養(yǎng)基的總糖質量濃度，g/L；ρS，開始補料時段的罐內總糖質量濃度，g/L；t，指數補料時間，h。

補料方式[15]：采用脈沖型蠕動泵補料，但難以實現隨時間的精確變化的補料速度。因此，采用時間差分法進行補料速率的計算和控制。設定每2 h更改補料速率，即以補料開始時間t時刻更改補料速率，該速率在t～t+2時間段持續(xù)，根據公式計算該2 h內的平均補料速度，計算t值取中間時刻t+1。

以μ=0.02 h-1為例，補料速率的計算值和操作值如圖1所示。

圖1 擬指數補料的理論流速與實際操作流速

Fig.1 The theoretical feeding rate and the actual set valueof the quasi-exponential

(3)DO-Stat補料：在分批培養(yǎng)的基礎上，當溶氧開始上升后，啟動DO-Stat機制進行補料。當溶氧高于設定值時，通過反饋機制開啟蠕動泵加入培養(yǎng)基，溶氧低于設定值時，通過在線自動控制提高轉速，在該過程中將通氣調整在7.0 L/min。pH值、溫度、泡沫控制與分批培養(yǎng)相同。

(4)兩階段補料：采用上罐培養(yǎng)基進行分批培養(yǎng)，在21 h左右溶氧上升，按照擬指數補料方式進行補料，在48 h左右溶氧跌到20%以下并有乙醇產生時，調整為DO 40%的DO-stat補料。

1.7 分析方法

總糖測定:斐林試劑滴定法[16]。

乙醇測定：HPLC法[17]。發(fā)酵液在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液進行0.22 μm膜過濾處理，濾液進行HPLC(Dionex，USA)測定。液相色譜條件：Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8mm，9 μm，Hercules，CA)；RI檢測器(Shodex RI-101，Japan)和UV檢測器(Dionex，USA)；流動相5 mmol/L H2SO4；柱溫65 ℃；流速0.6 mL/min；進樣量20 μL。

菌體干重(dry cell weight，DCW)：取發(fā)酵液置于烘干至恒重的離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用去離子水反復洗滌離心菌體3～4次。于真空干燥箱中干燥至恒重。稱量計算菌體干重。

菌體得率：生成菌體與所消耗糖的質量比值。按公式(2)計算：

(2)

其中：YX/S，菌體得率，%；X，總的菌體干重，g；S，總的糖消耗質量，g。

生產強度：單位體積反應器的生產能力。計算采用公式(3)：

(3)

其中：P，生產強度，g/(L·h)；ρ，菌體質量濃度，g/L；T，培養(yǎng)時間，h。

2 結果與討論

2.1 初始糖濃度優(yōu)化

將底物濃度定為上罐培養(yǎng)基的1.5倍和2.0倍進行分批培養(yǎng)與初始上罐培養(yǎng)基結果進行比較，結果如表2所示，隨著培養(yǎng)基濃度的提高，菌體量僅有小幅提升，但是生長周期和最大乙醇產量卻大大增加。說明培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質增加到一定濃度時，菌體生長顯示飽和動力學，底物濃度的進一步增加引起底物抑制，使得遲滯期延長[18]；而且過量的碳源引起Crabtree效應，使得糖代謝從TCA循環(huán)轉至乙醇合成途徑，導致大量乙醇的產生，抑制了細胞密度的進一步提高[19]。因此，分批培養(yǎng)難以實現高密度的水平，要提高細胞密度，需采用補料培養(yǎng)的方式。

表2 不同底物質量濃度下酵母生長參數比較

注：a-以標準偏差(SD) 表示；b、c，分別為1.5倍、2.0倍培養(yǎng)基濃度中初總糖濃度；其中培養(yǎng)基各成分均以上罐培養(yǎng)基為基礎按照倍數增加。

2.2 擬指數補料條件下酵母的生長特性

擬指數補料是一種根據菌體生長規(guī)律制定補料速率的方法，理論上可以使菌體在最佳狀態(tài)下生長[20]，因此本文采用控制比生長速率的擬指數補料。開始補料的初始條件以分批結束時的生長狀態(tài)為準，初始體積為3.0 L、菌體質量濃度為32 g/L、補料開始糖質量濃度為10.0 g/L。分別在比生長速率為0.02、0.03、0.04 h-1條件下考察補料效果(圖2)。

結果如圖2所示，隨著比生長速率的提高，酵母的生長周期明顯縮短。但是在不同的比生長速率控制條件下，后期均有乙醇出現，乙醇的出現均與溶氧的下降同時發(fā)生，μ為0.02、0.03、0.04 h-1分別在60、48、42 h溶氧降到20%以下甚至更低。該現象應該是由于菌體濃度較大，有限的通風攪拌供氧已經難以維持酵母的有氧呼吸，造成Crabtree效應，此時酵母的生長速率已經難以維持在設定值[15,19]。

A-μ=0.02 h-1；B-μ=0.03 h-1；C-μ=0.04 h-1圖2 擬指數補料流加培養(yǎng)過程圖

Fig.2 The culture process with quasi-exponential feeding at specific growth rate

從表3可以看出，乙醇溢流代謝的出現導致糖的利用率下降，最大的菌體量出現在μ為0.02 h-1時，也僅有100.5 g/L，說明單一的擬指數補料并不適合于釀酒酵母的高密度培養(yǎng)。但是本研究發(fā)現，在TE時刻之前，并沒有導致糖的累積和乙醇的出現，該階段酵母的生產強度較高，μ為0.02、0.03、0.04 h-1分別達到1.03、1.55、1.61 g/(L·h)，高于全過程的生產強度。而在TE之后，由于糖的流加速率大于酵母的消耗速率才使得糖累積、Crabtree效應出現。因此，在溶氧下降之后可以適當降低流加速率，避免該現象的發(fā)生。考慮到操作的易行性，可以采取后期進行DO-stat流加。本文選擇μ為0.03 h-1是比較適合的。因為在0～TE，相比于μ為0.04 h-1的補料，μ為0.03 h-1的生產強度僅低了3.8%；TE時刻流加培養(yǎng)基的體積為0.82 L，低于μ為0.04 h-1的1.14 L，但此時DCWE卻高出2.9%，說明在TE時刻之前,菌體生長已經不能遵循預設的0.04 h-1的比生長速率，一部分糖已經出現累積，這在圖3中也可以看出。

2.3 DO-Stat補料條件下酵母的生長特性

酵母的高密度培養(yǎng)制約因素主要來自于兩個方面[14]：一是供氧不足導致酵母發(fā)生厭氧代謝生成乙醇；二是當培養(yǎng)基中的糖濃度較高時產生Crabtree效應，糖溢流代謝生成乙醇。兩者均會影響糖的轉化率。所以，對于酵母的培養(yǎng)應當從控制溶氧和控制糖濃兩方面入手。由于無法實時監(jiān)控發(fā)酵罐內糖的濃度，而離線檢測存在一定的滯后性，容易造成糖的累積或缺乏，目前難以通過糖濃度控制補料速率。

表3 擬指數補料中不同比生長速率酵母生長參數比較

注:TE指乙醇出現時的時間；DCWE指乙醇出現時刻DCW。下同。

溶氧是反映菌體生長的一個指標，當糖足夠且菌體生長旺盛時，表現溶氧下降；糖濃不足時，菌體會由于饑餓死亡，表現為溶氧上升。所以考慮采用DO-stat的手段進行反饋流加，使得溶氧維持在一定水平，既不因為溶氧不足或糖濃過高產生乙醇溢流代謝，也不會出現供糖不足造成的菌體死亡的現象[21-23]。

在21 h可發(fā)酵性糖及乙醇消耗完畢后，在10 min內溶氧急劇上升至超過設定溶氧值10%以上，啟動溶氧反饋流加。分別將溶氧設定為30%、40%、50%對酵母進行補料培養(yǎng)。從圖3中可以看出，溶氧的設定對酵母的生長有較大的影響，隨著設定溶氧值的升高，當轉速上升到一定高度時，為了維持較高溶氧，培養(yǎng)基的流加速率逐漸降低，使得體系中糖無法累積甚至溶氧過高時，菌體出現饑餓狀態(tài)，導致酵母生長減緩，發(fā)酵周期延長。當設定溶氧值較低時，為了匹配較低溶氧，糖的流加速率加快，使得酵母快速生長繁殖，溶氧保持在較低水平，但是由于溶氧的降低以及糖的積累使得更多的糖流向乙醇代謝，對酵母生長造成不利，影響原料利用。

A-30% DO；B-40% DO；C-DO 50%圖3 DO-stat補料流加培養(yǎng)過程圖

Fig.3 The culture process with DO-stat feeding at dissolved oxygen concentrations

因此，一個合適的溶氧水平對酵母的流加培養(yǎng)是至關重要的。從表4可以看出，DO為40%時的DCW、菌體得率是最高的,且各條件下均未發(fā)現明顯的乙醇累積，說明合適的DO-stat可以有效達到高密度水平，抑制Crabtree效應。但是較長的培養(yǎng)周期嚴重影響了菌體的生產強度，即使在最優(yōu)的DO40%時，生產強度也只有1.004 g/(L·h)。

合適的DO-stat雖然能夠得到比較高的菌體濃度，但是其生長周期較長，降低了體積生產率。對于企業(yè)生產尤其是比較廉價的酵母來講，生產效率也是決定產業(yè)利益的一個重要因素。因此，如何在保證較高菌體濃度的前提下，提高生產強度是提高酵母生產能力的關鍵。

表4 DO-stat補料中不同溶氧水平酵母生長參數比較

2.4 擬指數結合DO-stat的兩階段補料條件下酵母的生長特性

基于擬指數和DO-stat各有優(yōu)缺點，因此將二者進行結合，首先在糖和乙醇消耗完畢之后進行μ為0.03 h-1的擬指數補料，在擬指數補料的第48 h產生乙醇之前，將補料方式改為溶氧為40%DO-Stat，降低補料速率，減緩生長，將溶氧控制在合適范圍。結果如圖4所示。

圖4 擬指數—DO-stat兩階段補料流加培養(yǎng)過程圖

Fig.4 The culture process with two-step feeding strategy

從圖4可以看出，兩階段補料可以有效解決指數補料后期溶氧不足、乙醇積累的問題，并且可以提高DO-stat過程中菌體的生長速率。經過108 h的兩階段補料可得到123.57 g/L的菌體、0.51 g/g的總菌體得率和1.15 g/(L·h)的生產強度。相對于DO-stat培養(yǎng)周期縮短了20.4%，生產強度提高了15%，達到了預期的高密度培養(yǎng)的目標。

擬指數補料由于后期溶氧難以維持，實際比生長速率低于設定值造成糖累積，產生乙醇代謝，通過將乙醇出現之后階段的補料方式調整為DO-stat補料，可以有效解決該問題，因此將補料前期設定為高速生長的擬指數補料，后期切換可避免乙醇代謝的DO-stat補料，可以有效綜合兩種補料的優(yōu)勢，提高酵母生長水平。

3 結論與討論

酵母培養(yǎng)中，如果有乙醇溢流代謝的出現，不可避免的會造成細胞濃度的下降。保持釀酒酵母生長中非常低水平的乙醇，可以有效實現高濃菌體量，提高糖的轉化率。因此，為了在釀酒酵母的培養(yǎng)過程中獲得高產量的菌體，糖濃度必須滿足兩點：一是足夠滿足酵母生長需求，二是避免過量而產生溢流代謝[24-25]。合理的補料方式是提高酵母生長能力，提高菌體密度的關鍵。

單一的恒速或指數補料可以解決分批培養(yǎng)中菌體濃度較低的問題，使酵母快速增殖達到較高菌體濃度，但是Crabtree效應難以避免，糖的轉化率總是難以保證。例如KIM等[26]使用釀酒酵母JUL3利用50%糖蜜進行恒速補料培養(yǎng)80 h后得到95.7 g/L DCW；康遠軍[27]采用μ為0.05 h-1的指數補料培養(yǎng)魯氏酵母48 h得到72.91 g/L的DCW，菌體得率僅為0.3 g/g。為了解決Crabtree效應，有學者采用在指數補料后期將比生長速率降低或者全程保持較高溶氧，這樣可以避免乙醇產生，但是也會帶來生產效率較低或菌體濃度較低的問題。例如，季萌等[15]使用釀酒酵母AFY-1利用優(yōu)化的線性減少比生長速率的指數補料方式，培養(yǎng)102 h后得到77.5 g/L DCW；GAO等[28]對釀酒酵母采用DO-stat補料培養(yǎng)50 h得到了51.2 g/L的DCW。

總體來講，傳統(tǒng)的單一補料方式很難進行全局調控，菌體濃度很難高于本研究的兩階段補料。本研究提出了兩階段補料，在前期進行擬指數補料，在后期由于菌體濃度高溶氧難以維持、造成乙醇溢流代謝時將補料方式切換為DO-stat補料。同時解決了細胞增殖緩慢與殘?zhí)抢鄯e、乙醇代謝的問題，可有效提高生產強度、提高菌體得率。經過108 h的兩階段補料培養(yǎng)可以得到123.57 g/L的DCW。比分批培養(yǎng)和擬指數補料分別高了286%和23.8%；菌體得率達到0.51 g/g，比分批培養(yǎng)和指數補料分別高了13.3%和6.25%；相比DO-stat補料，生長周期縮短了20.4%，生產強度提高了14.6%。表明兩階段補料模式可以有效地提高酵母生長能力，達到高密度培養(yǎng)水平，在生產上具有明顯的優(yōu)勢。