奧拉西坦腹腔注射后缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬組織形態(tài)變化及NFP、CRMP-2表達(dá)觀察

張洋，王顯鶴，吳祥紅

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是一種彌漫性腦損傷， 腦缺氧缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)異常[1]。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分、是HIBD損傷中最敏感的部位之一,海馬損傷可直接導(dǎo)致空間記憶和學(xué)習(xí)能力下降[2]。奧拉西坦是一種新的環(huán)狀3-羥基-4-氨基丁酸衍生物，可作用于大腦皮層和海馬組織，保護(hù)、激活或促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù),起效迅速，擁有良好的耐受性和安全性，臨床效果顯著[3]，但其對(duì)HIBD起治療作用的病理及分子機(jī)制仍不明確。研究[4]發(fā)現(xiàn)，HIBD時(shí)，有眾多分子通過多種途徑參與神經(jīng)元再生或壞死過程，其中Rho信號(hào)通路是重要信號(hào)傳導(dǎo)通路之一,坍塌反應(yīng)介導(dǎo)蛋白-2(CRMP-2)是Rho通路下游底物分子，是一種抑制分子，屬于CRMPs家族代表性成員，其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架形態(tài)抑制或促進(jìn)神經(jīng)元再生。NFP是反映神經(jīng)元和突觸功能狀況最敏感的指標(biāo)，也是構(gòu)成神經(jīng)細(xì)胞骨架的重要成員之一[5]，在NFP蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、磷酸化過程中，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，可致使軸突的結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重受損，繼而導(dǎo)致神經(jīng)元退化和死亡。2018年3～10月，本研究參照Rice法建立新生大鼠HIBD模型，觀察了奧拉西坦作用后HIBD新生大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)及NFP、CRMP-2表達(dá)的變化，以探討其對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑、儀器 120只清潔級(jí)7日齡Wistar大鼠(由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雄性或雌性，體質(zhì)量(12.5±3)g，在室溫22 ℃，濕度50%條件下常規(guī)鼠飼料喂養(yǎng)；混合氣體(氮?dú)猓?2%，氧氣：8%，佳木斯市金鼎氧氣廠)；奧拉西坦注射液(廣東世信藥業(yè)有限公司)；CRMP-2抗體(英國(guó)Abeam公司)；NFP抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；SABC(兔IgG)試劑盒(武漢博士得生物工程有限公司)；磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液、DAB顯色液、抗體稀釋劑(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)；自制氧艙及水浴槽、CY-12C便攜式測(cè)氧儀(上海龍托儀器設(shè)備有限公司)；HC-TP12A-1架盤藥物天平(北京醫(yī)用天平廠)；石蠟切片機(jī)(沈陽(yáng)市龍首電子儀器有限公司)；攤烘烤片機(jī)(上海艾測(cè)電子科技有限公司)；病理石蠟包埋機(jī)HD-310(湖北慧達(dá)儀器有限公司)；全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)(湖北歐美萊醫(yī)療科技有限公司)；NiKon E100顯微鏡(尼康儀器北京有限公司)。

1.2 Wistar大鼠分組、HIBD模型制備、奧拉西坦腹腔內(nèi)注射 120只7日齡Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組和治療組，每組40只。對(duì)照組大鼠僅手術(shù)分離左頸總動(dòng)脈，并且未進(jìn)行永久性結(jié)扎，不做低氧處理。模型組大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，于頸部正中切口，分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，將動(dòng)物靜置2 h，并置于含有8%氧氣的密閉容器中2 h，制備成HIBD模型。將出現(xiàn)左旋夾尾或夾尾左旋者納入實(shí)驗(yàn)，缺氧后10 min腹腔注射生理鹽水0.1 mL/kg。治療組于模型制備成功后6 h、12 h、24 h、72 h、7 d分別腹腔注射100 mg/kg奧拉西坦注射液。

1.3 大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)觀察及其CRMP-2、NFP蛋白檢測(cè) 分別于模型制作成功后6 h、12 h、24 h、72 h、7 d處死大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死8只。每組新生大鼠用乙醚吸入麻醉，直立固定在手術(shù)板上， 開顱手術(shù)取腦組織，置于4%多聚甲醛中72 h。在腦組織下沉后，取出并石蠟固定，儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中。以冠狀位的視交叉后約1 mm為第一切點(diǎn)，冠狀位后約3 mm處為第二切點(diǎn)，將固定好的大腦標(biāo)本切成約5 mm×5 mm×5 mm的組織塊，然后流水洗滌過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯浸漬蠟，放入盛有蠟溶液的鋁制包埋盒中，迅速冷卻凝固后去除鋁制包埋盒，用石蠟切片機(jī)將蠟塊連續(xù)切割成薄片，片厚約5 μm，切片的范圍從出現(xiàn)前聯(lián)合處開始到出現(xiàn)副海馬體為止，然后經(jīng)展片、撈片、烤片后保存?zhèn)溆?。進(jìn)行HE染色觀察各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化。采用免疫組化染色法檢測(cè)大鼠海馬組織CRMP-2和NFP蛋白,參照武漢博士德SABC-AP試劑盒說(shuō)明步驟操作。隨機(jī)選擇每個(gè)切片5個(gè)非重復(fù)區(qū)域，在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)CRMP-2和NFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算平均值。結(jié)果判定：CRMP-2和NFP陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)被染成棕褐色或棕黃色。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)海馬組織結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞層次清晰，核仁明顯，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞間連接緊密，無(wú)水腫、壞死。模型組在模型建立成功后6 h細(xì)胞無(wú)明顯改變；模型建立成功后12～24 h時(shí)細(xì)胞水腫，胞質(zhì)疏松，淡染空殼，神經(jīng)元數(shù)目減少，排列紊亂；模型建立成功后72～7 d細(xì)胞核固縮、裂解，炎性細(xì)胞增多，可見液化壞死灶伴膠質(zhì)細(xì)胞增生及點(diǎn)狀出血。治療組在各時(shí)點(diǎn)大部分神經(jīng)元腫脹，間質(zhì)水腫較模型組明顯減輕，胞質(zhì)及胞核較清晰，神經(jīng)細(xì)胞水腫及核固縮數(shù)目明顯少于同時(shí)點(diǎn)模型組，腦組織開始修復(fù)。

2.2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬組織NFP、CRMP-2表達(dá)比較 對(duì)照組大鼠海馬組織NFP表達(dá)很少；模型組NFP在模型建立成功后6 h表現(xiàn)出少量表達(dá)，并在12 h開始下降，然后在24 h下降至最低，隨后逐漸增加,見圖1。治療組海馬組織NFP各時(shí)點(diǎn)NFP表達(dá)均高于模型組(P均<0.05),見表1。對(duì)照組大鼠CRMP-2在各時(shí)點(diǎn)表達(dá)量比較，P均<0.05。HIBD模型組CRMP-2表達(dá)量在模型建立成功后12 h時(shí)開始增加，在72 h時(shí)達(dá)到最高值，并在7 d后開始減少,見圖2。治療組中CRMP-2的表達(dá)在模型建立成功后12 h時(shí)開始增加，在24 h達(dá)到最高水平后，開始下降，治療組中CRMP-2各個(gè)時(shí)點(diǎn)的表達(dá)低于模型組(P均<0.05),見表2。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬組織NFP表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)海馬組織CRMP-2表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖1 不同時(shí)點(diǎn)各組新生大鼠NFP的表達(dá)

圖2 不同時(shí)點(diǎn)各組新生大鼠CRMP-2的表達(dá)

3 討論

新生兒HIBD為新生兒期危害最大的常見疾病之一，經(jīng)常引起新生兒死亡和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育障礙。在中國(guó)每年出生的新生兒中，有大約30萬(wàn)患兒出現(xiàn)因HIBD引起的臨床后遺癥，導(dǎo)致腦癱、癲癇、智力低下、視聽障礙等永久性腦損傷以及不同程度的殘疾[4]。奧拉西坦在臨床治療HIBD方面取得較好療效，但其作用機(jī)制尚不明確，本研究以新生大鼠為研究對(duì)象，建立HIBD模型后給予奧拉西坦治療，并通過病理學(xué)觀察和免疫組化法探討其療效和作用機(jī)制。

NFP在動(dòng)物成熟神經(jīng)元和有髓鞘的軸突中廣泛存在，可保持軸突結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，是神經(jīng)元存活及發(fā)揮功能的必要蛋白[5]。NFP不僅起支持細(xì)胞、決定細(xì)胞形狀的作用,還參與一些細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分化、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)分布及跨膜信號(hào)的傳遞等一系列重要生物過程[6]。有報(bào)道[6]顯示，NFP的表達(dá)與學(xué)習(xí)和記憶功能呈明顯正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠NFP表達(dá)較少，模型組和治療組大鼠NFP表達(dá)升高;NFP在模型組和治療組中的表達(dá)均隨時(shí)間呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)，但以治療組為著;提示奧拉西坦可提高HIBD大鼠NFP的表達(dá)，促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)，另一方面也說(shuō)明大鼠機(jī)體有自我調(diào)節(jié)的功能，能夠自發(fā)上調(diào)NFP表達(dá)量，改善神經(jīng)元功能，但這種作用與奧拉西坦相比明顯較弱。

CRMPs在中樞神經(jīng)的發(fā)育過程中高度表達(dá)，分布在成年腦組織的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞中，與神經(jīng)元的發(fā)育密切相關(guān)。有研究[7～11]顯示，CRMP-2是Rho、CDK5和GSK3的底物，參與生長(zhǎng)錐的塌陷、軸突生長(zhǎng)、缺血和阿爾茨海默病的發(fā)病等,CRMP-2在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)，并在軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠CRMP-2表達(dá)較模型組、治療組低，說(shuō)明HIBD可使CRMP-2的表達(dá)量增加。本研究還發(fā)現(xiàn)，在每個(gè)時(shí)點(diǎn)，治療組CRMP-2的表達(dá)均低于模型組，與文獻(xiàn)[12,13]報(bào)道結(jié)論相符，說(shuō)明奧拉西坦可通過下調(diào)CRMP-2的表達(dá)而對(duì)HIBD大鼠神經(jīng)元起保護(hù)作用。此外，本次研究結(jié)果中模型組大鼠CRMP-2的表達(dá)在模型建立成功后72 h開始下降，而治療組在24 h開始降低，提示大鼠機(jī)體自身也有一定的自我恢復(fù)機(jī)制，但這種自我恢復(fù)機(jī)制的功能較弱，發(fā)生時(shí)間也較晚。

綜上所述，奧拉西坦可通過抑制CRMP-2表達(dá)、增加NFP表達(dá)，從而對(duì)HIBD新生大鼠的神經(jīng)元起保護(hù)作用。大鼠機(jī)體自身對(duì)HIBD有一定的自我恢復(fù)機(jī)制，能夠在一定程度上降低HIBD造成的神經(jīng)元損傷。目前關(guān)于CRMPs家族的研究不多，其家族的其他成員是否也參與HIBD的發(fā)生過程需進(jìn)一步探討。