磷蛋白32高表達(dá)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251加入替莫唑胺、H2O2、乙醇后的增殖活性變化及其機(jī)制

李丹丹，孫春霞，喬媛媛，馬偉，馮友新，張達(dá)矜，

(1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510515；2中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)且預(yù)后最差的惡性腫瘤。由于膠質(zhì)瘤呈彌漫性生長(zhǎng)，并影響和侵襲正常腦組織，手術(shù)常難徹底切除，且術(shù)后放療效果欠佳[1]。手術(shù)、放療和輔以替莫唑胺(TMZ)化療是目前新診斷的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者首選治療方案，但是效果并不理想[2]。富含酸性的核磷蛋白32家族成員(ANP32)家族蛋白與腫瘤進(jìn)展，損傷保護(hù)以及藥物耐受密切相關(guān)。其中磷蛋白32(pp32)最初發(fā)現(xiàn)時(shí)被認(rèn)為是一種抑瘤因子，然而隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)其與肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，并參與調(diào)控胰腺癌、乳腺癌等對(duì)化學(xué)毒物的敏感性[3,4]。我們前期研究[5]表明，pp32在哺乳動(dòng)物腦組織中高表達(dá)，并參與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程。最近研究[6]表明，pp32在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，但其在膠質(zhì)瘤病情進(jìn)展、耐藥機(jī)制中的作用尚不明確。2016年10月～2018年10月，我們觀察了pp32高表達(dá)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251加入TMZ、H2O2以及乙醇作用后細(xì)胞增殖活性的變化，并探討了其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、pp32慢病毒、試劑及儀器 細(xì)胞：人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251(北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞資源中心)。該細(xì)胞在含有10%胎牛血清以及100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。pp32高表達(dá)慢病毒、pp32高表達(dá)陰性對(duì)照慢病毒、pp32干擾慢病毒以及pp32干擾陰性對(duì)照慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因公司)。主要試劑：人pp32重組蛋白為本實(shí)驗(yàn)室制備和保存[7]。MEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素(Gibco公司)，胎牛血清(Sciencell公司)，CCK-8試劑盒(Dojindo公司)，pp32、actin以及人類(lèi)抗原R(HuR)抗體(Santa Cruz公司)，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、二步法免疫組化檢測(cè)試劑以及DAB顯色試劑盒(中杉金橋公司)，TMZ(sigma公司)，30% H2O2、無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)以及生物安全柜(Thermo公司)，普通光學(xué)顯微鏡、熒光倒置相差顯微鏡(Nikon公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀以及酶標(biāo)儀(伯樂(lè)公司)，ImageQuant LAS 4000凝膠成像儀(GE公司)。

1.2 穩(wěn)定低或高表達(dá)pp32 U251細(xì)胞株的建立及篩選 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，3×106/孔接種于6孔板培養(yǎng)12 h后，按照細(xì)胞與病毒1∶10的比例加入慢病毒，8 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)基，待繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入終濃度為3.5 μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)2周構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，pp32高表達(dá)慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞作為32A組，pp32高表達(dá)陰性對(duì)照慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞作為32A-C組，pp32干擾慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞作為siA組，pp32干擾陰性對(duì)照慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞株作為siA-C組。未經(jīng)轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞作為NC組。采用Western blotting法檢測(cè)pp32蛋白以明確目的細(xì)胞株的構(gòu)建是否成功。

1.3 加入TMZ、H2O2、無(wú)水乙醇后各組U251細(xì)胞增殖活性的檢測(cè) ①采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞光密度值(OD值)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期32A、32A-C、siA、siA-C組細(xì)胞以及正常U251細(xì)胞(NC組)按照5×103/孔接種于96孔板中8 h后，分別加入100 μg/mL TMZ、0.15 mmol/mL H2O2以及600 mmol/mL乙醇，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于0、12、24 h后加入CCK-8試劑10 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處的OD值。②采用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測(cè)細(xì)胞中PCNA蛋白。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期32A、32A-C、siA、siA-C組細(xì)胞以及正常U251細(xì)胞(NC組)按照5×103/孔接種于96孔板中8 h后，分別加入100 μg/mL TMZ、0.15 mmol/mL H2O2以及600 mmol/mL乙醇，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min；3% H2O2室溫孵育細(xì)胞10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；0.5% TritonX-100冰上孵育20 min；10%胎牛血清室溫封閉1 h；加入一抗PCNA工作液后4 ℃過(guò)夜孵育；二抗(1)(反應(yīng)增強(qiáng)液)以及二抗(2)(增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)于37 ℃分別孵育30 min；加入新鮮配制的DAB顯色。顯微鏡下觀察并拍照，Image J分析其積分光密度(IOD)值。

1.4 加入人pp32重組蛋白后U251細(xì)胞內(nèi)HuR蛋白的檢測(cè) 采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色以及Western blotting法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞按照5×103/孔以及3×106個(gè)/孔分別接種于96以及6孔板中，培養(yǎng)12 h后分別加入終濃度為0、50 ng/mL的人pp32重組蛋白，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，96孔板中的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min；3% H2O2室溫孵育細(xì)胞10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；0.5% TritonX-100冰上孵育20 min；10%胎牛血清室溫封閉1 h；加入一抗HuR(稀釋比例1∶200)后4 ℃過(guò)夜孵育；二抗(1)(反應(yīng)增強(qiáng)液)以及二抗(2)(增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)于37 ℃分別孵育30 min；加入新鮮配制的DAB顯色，顯微鏡下觀察并拍照，觀察HuR在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的定位。棄掉6孔板中細(xì)胞上清液，加入蛋白裂解液，行蛋白定量后用于上樣跑膠。恒電壓電泳，濃縮膠80 V，30 min；10%分離膠120 V電泳后，調(diào)節(jié)恒流300 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h；5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h；一抗HuR(稀釋比例1∶1 000)以及actin(稀釋比例1∶1 000)4 ℃過(guò)夜孵育；HRP標(biāo)記二抗(稀釋比例1∶5 000) 孵育1 h后；用ECL液在凝膠成像儀Image Quant LAS4000中顯影。將顯影好的內(nèi)參與目的蛋白的條帶用Image J分析并記錄。目的蛋白灰度值/actin灰度值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

U251細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒后，在熒光顯微鏡下觀察，與NC U251細(xì)胞相比，32A、32A-C、siA和siA-C細(xì)胞顯示綠色熒光，病毒感染效率約90%，且細(xì)胞形態(tài)、活力均良好。NC、32A、32A-C、siA-C和siA組pp32蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.231±0.001、0.248±0.009、0.530±0.045、0.253±0.007、0.113±0.015；與NC以及32A-C組相比，32A組細(xì)胞中pp32蛋白表達(dá)量高(t分別為-9.45、-8.73，P均<0.05)；與NC以及siA-C組相比，siA組細(xì)胞中pp32蛋白表達(dá)量降低(t分別11.02、14.12，P均<0.05)。說(shuō)明pp32高/低表達(dá)U251細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2.1 加入TMZ、H2O2、乙醇后各組細(xì)胞增殖活性比較 與0、12 h相比，分別加入TMZ、H2O2以及乙醇24 h，U251細(xì)胞OD值降低(P均<0.05)。分別加入TMZ、H2O2以及乙醇24 h，與NC以及32A-C組相比，32A組細(xì)胞OD值升高；與NC以及siA-C組相比，siA-C組細(xì)胞OD值下降(P均<0.05)；詳見(jiàn)表1。與NC以及32A-C組相比，32A組細(xì)胞PCNA相對(duì)表達(dá)量增加(P均<0.05)；與NC以及siA-C組相比，siA組細(xì)胞PCNA相對(duì)表達(dá)量減少(P均<0.05)；詳見(jiàn)表2。

表1 分別加入TMZ、H2O2、乙醇后培養(yǎng)不同時(shí)間 各組細(xì)胞OD值

2.2 加入人pp32重組蛋白后，U251細(xì)胞中HuR蛋白的定位及其表達(dá)變化 加入0 ng/mL的人pp32重組蛋白后細(xì)胞核中的HuR表達(dá)多，加入50 ng/mL的人pp32重組蛋白后細(xì)胞質(zhì)中的HuR表達(dá)多。Western blotting結(jié)果顯示，U251細(xì)胞中加入0、50 ng/mL人pp32重組蛋白后，細(xì)胞中HuR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.564±0.026、0.583±0.015，二者比較，t=-0.892，P>0.05；細(xì)胞質(zhì)中HuR蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.156±0.001、0.398±0.021，二者比較，t=-16.01，P<0.05。

表2 分別加入TMZ、H2O2、乙醇后各組細(xì)胞中PCNA蛋白 相對(duì)表達(dá)量

3 討論

酸性核磷蛋白32家族成員包括pp32、肝細(xì)胞生成素Cn、ANP32B等，是一類(lèi)進(jìn)化上高度保守的多功能蛋白，其功能涉及到細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等多種不同的生物學(xué)事件[7～9]。其中，pp32發(fā)現(xiàn)最早，亦被命名為ANP32A，因其與腫瘤廣泛聯(lián)系，研究也最為深入。pp32可以抑制癌細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、激活增殖相關(guān)信號(hào)通路從而促進(jìn)細(xì)胞遷移和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等[10]，其主要作用機(jī)制:①可作為mRNA結(jié)合蛋白HuR的配體，參與mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響HuR蛋白在細(xì)胞核質(zhì)之間的穿梭；②能夠與微管相關(guān)蛋白結(jié)合以及參與微管功能的調(diào)控，從而影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞以及物質(zhì)的運(yùn)輸；③pp32作為乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑因子復(fù)合物的主要組成部分，在調(diào)控組蛋白的乙?；⒘姿峄约稗D(zhuǎn)錄中起著重要作用；④可以抑制蛋白磷酸酶2A的生物活性等。前期研究[11]中，我們采用人多組織芯片分析結(jié)果顯示pp32呈多組織分布，而在腦組織中表達(dá)水平最高，并可能參與哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程。研究[12,13]表明，pp32在神經(jīng)系統(tǒng)中行使重要的生物學(xué)功能，如pp32在胚胎腦組織中高表達(dá)，與腦組織發(fā)育有關(guān)；通過(guò)引起表觀遺傳改變調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化；在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中與微管結(jié)合蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)軸突形成；pp32降低與神經(jīng)變性疾病脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)有關(guān)；CXCL12/CXCR4刺激pp32表達(dá)升高，使其與Rb相互作用，保護(hù)興奮性毒素引起的神經(jīng)元損傷。

膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)原發(fā)性惡性腫瘤。一些頭顱損傷，化學(xué)藥物損傷如過(guò)氧化物、乙醇等，環(huán)境致癌物和飲食等均與膠質(zhì)瘤發(fā)病有關(guān)[14],由于其呈彌漫性生長(zhǎng)，并影響和侵襲正常腦組織，手術(shù)常難徹底切除，且術(shù)后放療效果欠佳[15]。TMZ是咪唑并四嗪類(lèi)烷化劑抗腫瘤藥，易透過(guò)血腦屏障，為膠質(zhì)瘤常見(jiàn)化療藥物。膠質(zhì)瘤耐藥是TMZ化療失敗的主要原因[16]。已有研究表明，酸性核磷蛋白32家族成員參與調(diào)控腫瘤耐藥過(guò)程。在胰腺癌中，Williams等[3]發(fā)現(xiàn)，pp32高表達(dá)可選擇性引起胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物阿糖胞苷和吉西他濱耐藥，但卻對(duì)氟尿嘧啶敏感；Hostetter等[4]研究發(fā)現(xiàn)，pp32表達(dá)升高可引起乳腺癌細(xì)胞質(zhì)中HuR累積，導(dǎo)致其對(duì)他莫昔芬耐藥。pp32可以通過(guò)上調(diào)Mcl-1等抗凋亡基因從而抑制多種化療藥物誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡[17]。

本研究通過(guò)加入H2O2和乙醇等化學(xué)毒物及TMZ對(duì)人pp32高/低表達(dá)U251細(xì)胞株進(jìn)行誘導(dǎo)損傷，檢測(cè)pp32對(duì)損傷細(xì)胞增殖活性的影響,結(jié)果顯示，與0、12 h相比，分別加入TMZ、H2O2、乙醇24 h，U251細(xì)胞OD值降低；分別加入TMZ、H2O2、乙醇24 h，與NC、32A-C組比較，32A組細(xì)胞OD值升高，PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)量增加;與NC、siA-C組比較，siA組細(xì)胞OD值降低，PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)量減少。提示pp32蛋白可使替莫唑胺、H2O2、乙醇作用后的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251增殖活性增強(qiáng)。

研究報(bào)道，HuR屬于RNA結(jié)合蛋白Hu家族成員，為核質(zhì)穿梭蛋白，與多種腫瘤的發(fā)生、損傷保護(hù)以及耐藥相關(guān)。HuR三個(gè)特異性結(jié)構(gòu)域與靶mRNA非翻譯區(qū)的1個(gè)或多個(gè)U-或AU-富集元件(AREs)結(jié)合，調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因(如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、Her-2等)mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄后翻譯，從而影響腫瘤發(fā)生與進(jìn)展。多種含有AREs的腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，如原癌基因、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和侵襲因子等均為HuR的靶基因。HuR參與腫瘤耐藥調(diào)控，HuR下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致乳腺癌對(duì)柔紅比星誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平下降，柔紅比星耐藥的MCF-7細(xì)胞株中多藥耐藥相關(guān)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2轉(zhuǎn)運(yùn)子高表達(dá)，而HuR及其調(diào)控靶基因表達(dá)明顯降低，恢復(fù)HuR表達(dá)則MCF-7細(xì)胞恢復(fù)對(duì)柔紅比星細(xì)胞毒的敏感性。HuR由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)遷移，并在細(xì)胞質(zhì)中裂解為活性狀態(tài)，與細(xì)胞毒性等致死性壓力應(yīng)激造成的細(xì)胞凋亡有關(guān)，而HuR由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)遷移是這一過(guò)程的限速步驟[18,19]，pp32作為HuR的適配子，參與調(diào)節(jié)HuR核質(zhì)穿梭、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能[20]。本研究結(jié)果顯示，pp32可以誘導(dǎo)HuR由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)遷移。提示pp32可能通過(guò)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HuR從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移而增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，pp32蛋白可使替莫唑胺、H2O2、乙醇作用后的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251增殖活性增強(qiáng)，其作用可能與促進(jìn)HuR從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示pp32可能通過(guò)調(diào)節(jié)HuR等蛋白表達(dá)和生物學(xué)功能，進(jìn)而參與調(diào)控膠質(zhì)瘤進(jìn)展、細(xì)胞損傷保護(hù)以及耐藥，其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。