冰片對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型的影響

孫淑萍，杜云艷，鎖孝國(guó)，王 洋，張家豪，吳晨光，張夢(mèng)圓

炎癥是機(jī)體或細(xì)胞受到損傷、感染或者暴露于有害物質(zhì)（如LPS）時(shí)所產(chǎn)生的一種復(fù)雜的生理防御過(guò)程［1-2］.其主要表現(xiàn)為局部組織的變性、滲出和增生［2］.現(xiàn)代科學(xué)研究表明，炎癥與心臟病、某些形式的癌癥、糖尿病以及骨關(guān)節(jié)炎等密切相關(guān)［3］.當(dāng)機(jī)體受到外界因素刺激后，活化的巨噬細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子如NO等，引起機(jī)體固有免疫反應(yīng).

在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，巨噬細(xì)胞在啟動(dòng)、維護(hù)和解決炎癥反應(yīng)方面起著重要的作用［4］.脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，具有強(qiáng)大的免疫刺激能力［5］.RAW264.7巨噬細(xì)胞作為一種鼠源性免疫細(xì)胞，在受到外界因素（如LPS）刺激時(shí)會(huì)被激活，分泌眾多炎癥因子（如NO等），產(chǎn)生炎癥反應(yīng).此外，LPS作用于巨噬細(xì)胞可激活下游NF-κB和MAPKs炎性信號(hào)通路，產(chǎn)生炎癥因子［6］.炎癥因子的多少可間接地反映出炎癥的嚴(yán)重程度，是炎癥輕重的量化指標(biāo).

冰片（Borneol）是常用中藥材，有悠久的藥用歷史.唐代《新修本草》記載:冰片具有清熱止痛、散郁火、生肌的功效.現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，冰片具有抗細(xì)菌、真菌，消炎鎮(zhèn)痛等作用［7］.筆者通過(guò)查閱目前國(guó)內(nèi)外對(duì)冰片的研究發(fā)現(xiàn)，科研人員對(duì)冰片的研究主要集中在其化學(xué)成分及其提取工藝的分析和毒性及其機(jī)制的探討［8-9］，只見(jiàn)少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道冰片的抗炎作用，如孫曉萍［10］等研究表明，冰片對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹、冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加均有明顯的抑制作用，但體外抗炎活性及其作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道.

本實(shí)驗(yàn)選用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞作為體外炎癥模型［11］，考察了冰片對(duì)炎癥因子NO及ROS含量的影響，對(duì)抗炎分子機(jī)制是否與NF-κB、MAPKs及Nrf2炎性信號(hào)通路有關(guān)進(jìn)行討論，為冰片更合理應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)報(bào)道如下.

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

RAW264.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株由皖南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室戚之琳教授惠贈(zèng).

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料

冰片（批號(hào):180311，含量99%，吉安市林科天然冰片廠）；醋酸地塞米松片（批號(hào):160929，浙江仙琚制藥股份有限公司）；LPS凍干粉（Solarbio）；一氧化氮（NO）一步法試劑盒（南京建成生物工程研究所）；CCK-8法細(xì)胞增值檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；ERK1/2 Rabbit Monoclonal Antibody、Phospho-Erk1/Erk2 Rabbit Monoclonal Antibody、JNK Rabbit Monoclonal Antibody、Phospho-JNK Rabbit Monoclonal Antibody、 p38 RabbitMonoclonalAntibody、DCFH-DA活性氧檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Phospho-NF kappa B p65 Antibody、Phospho-p38 MAPKs Antibody（Affinity）；p65 RELA Rabbit Polyclonal Antibody、Nrf2 Rabbit Polyclonal Antibody、β-Tublin Mouse Monoclonal Antibody（Proteintech）；Mouse Anti-β-actin、Goat Anti-Mouse IgG、Rabbit Anti-HO-1/HMOX-1、Goat Anti-Rabbit IgG（武漢博士德生物工程有限公司）等.

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（GOLD-SIM）；生物安全柜（ESCO）；IX-51熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS）；垂直電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；Amersham Imager600超靈敏多功能成像儀（General Electric Company）；手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀（賽默飛世爾科技有限公司）.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 冰片的配制

精密稱取10mg冰片置于1.5mL EP管內(nèi)，加入4μL DMSO溶解，移至含有1mL PBS的15mL離心管中，反復(fù)吹打，再加入1mL PBS，反復(fù)吹打，依次遞增，重復(fù)上述步驟，最后補(bǔ)足至10mL，配成濃度為1mg/mL母液，用0.22μm無(wú)菌濾頭過(guò)濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?

2.1.2 LPS母液的配制

精密稱取1mg LPS凍干粉，加1mL完全培養(yǎng)基溶解，配成濃度為1mg/mL母液，用0.22μm無(wú)菌濾頭過(guò)濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?

2.1.3 Dex母液的配制

將醋酸地塞米松片充分研磨成細(xì)粉，過(guò)100目藥篩.精密稱取醋酸地塞米松細(xì)粉0.2826g（原料藥0.26g），加10mL完全培養(yǎng)基溶解，配成26mg/mL母液，用0.22μm無(wú)菌濾頭過(guò)濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?

2.2 RAW264.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)

RAW264.7使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d傳代1次，傳代比例為1∶7，傳代次數(shù)不超過(guò)15代.使用時(shí)，將細(xì)胞刮下，加入培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后，加入培養(yǎng)板各孔中.

2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

2.3.1 不同濃度冰片溶液對(duì)細(xì)胞活力的影響

RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)／孔種于96孔板，每孔體積100μL，培養(yǎng)2h，棄去上清液，藥物組每孔分別加入0.03μg/mL、0.3μg/mL、3μg/mL、30μg/mL、300μg/mL、600μg/mL冰片溶液各100μL；對(duì)照組棄去培養(yǎng)基，加入100μL完全培養(yǎng)基；空白組加入100μL完全培養(yǎng)基后不做處理；每個(gè)樣平行6份.外周一圈每孔加入100μL PBS緩沖液，繼續(xù)培養(yǎng)24h.藥物組和對(duì)照組每孔加入10μL CCK-8溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下（參比波長(zhǎng):600nm）測(cè)定OD值，計(jì)算各藥物濃度下的細(xì)胞存活率，統(tǒng)計(jì)并定量分析.選擇其中安全的藥物濃度范圍，進(jìn)一步摸索并確定合適的低、中、高劑量下的藥物濃度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).其中，細(xì)胞存活率（%）=（藥物組OD值-空白組OD值）（/對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%.

2.3.2 不同濃度LPS溶液對(duì)細(xì)胞活力的影響

除每孔加入 0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL LPS溶液各100μL外，其余和2.3.1項(xiàng)下相同.

2.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白（KB）組、模型（MX）組、醋酸地塞米松陽(yáng)性對(duì)照（Dex，YX）組、冰片低、中、高劑量組.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按1∶9的比例稀釋接種于6孔板中，各組先加1mL含有細(xì)胞的培養(yǎng)液，貼壁生長(zhǎng)2h.待細(xì)胞貼壁后將藥物組、醋酸地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組的培養(yǎng)基吸出（空白組、模型組不做處理），分別加入配好的各濃度藥液1mL，繼續(xù)培養(yǎng)30min.30min后空白組加1mL完全培養(yǎng)基；MX組、YX組與藥物組各加入2.4μg/mL LPS溶液1mL，使LPS終濃度為1.2μg/mL.

2.5 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞用藥24h后，從培養(yǎng)箱中取出6孔板，用OLYMPUS倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍攝照片（×200）.

2.6 一步法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子NO含量

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4℃，3000rpm，離心10min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定NO含量.

2.7 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞MAPKs通路蛋白的表達(dá)變化

取6孔細(xì)胞板中處理后的RAW264.7細(xì)胞，PBS洗滌后，加入細(xì)胞裂解液（RIPA∶PMSF∶廣譜磷酸酶抑制劑=100∶1∶1），至4℃冰箱裂解一段時(shí)間后取出，將細(xì)胞刮下，離心，取上清液加入5×上樣緩沖液，再于沸水中煮沸變性，經(jīng)BCA法檢測(cè)蛋白濃度后.用聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后轉(zhuǎn)至NC膜上，麗春紅染液染色，根據(jù)蛋白分子量與marker剪出所需蛋白的NC膜，TBST洗凈.用5%的脫脂牛奶封閉.用TBST洗凈，孵育Nrf2、p65、p-p65、ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK、β-actin一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗，分別加入相應(yīng)的二抗:HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶6000）和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶8000），室溫孵育1h，TBST洗凈，滴加現(xiàn)配的ECL顯影液（A液∶B液=1∶1）曝光顯影.用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析制作柱狀圖，目的蛋白表達(dá)量＝目的蛋白的灰度值／內(nèi)參蛋白的灰度值.

2.8 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)ROS含量變化

實(shí)驗(yàn)分組及用藥同操作2.4.用無(wú)血清培養(yǎng)液按1∶200稀釋DCFH-DA，使其終濃度為50μmol/L，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，按1mL/孔的量加入稀釋好的DCFH-DA，培養(yǎng)箱37℃孵育1h.用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA.再加入1mL PBS，使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)弱，拍照，用Image J軟件統(tǒng)計(jì)平均光密度值并定量分析.

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，p<0.05表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01表示差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同濃度冰片對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

冰片在0.03～600μg/mL濃度范圍內(nèi)時(shí)，RAW264.7細(xì)胞存活率高，倒置顯微鏡觀察也可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)完整，表明細(xì)胞未受到明顯損傷作用.因此，0.03～600μg/mL為安全藥物濃度區(qū)間，同時(shí)筆者進(jìn)一步優(yōu)化了藥物濃度，最終選擇1.5μg/mL、15μg/mL、150μg/mL分別作為低、中、高劑量組的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，詳情如圖1所示.

圖1 不同濃度冰片對(duì)細(xì)胞活力的影響

3.2 不同濃度LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

本研究中，在將不同濃度（0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL）LPS分別作用細(xì)胞 24h后，CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力結(jié)果顯示如圖2，LPS濃度為1.5μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降（p<0.05），而LPS濃度為2μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率極顯著性下降（p<0.01）.因此，可推斷出，LPS濃度<1.5μg/mL為安全濃度區(qū)間，后期進(jìn)一步優(yōu)化，選擇1.2μg/mL作為刺激巨噬細(xì)胞的濃度.

圖2 不同濃度LPS對(duì)細(xì)胞活力的影響

3.2 各組細(xì)胞的基本形態(tài)

KB組大部分細(xì)胞形態(tài)正常、似球形，有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生變形出現(xiàn)小角；MX組細(xì)胞在LPS的刺激下形態(tài)發(fā)生顯著改變，大部分細(xì)胞有較長(zhǎng)的觸角形成且形狀不規(guī)則，有部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，說(shuō)明造模成功；YX組細(xì)胞大部分呈圓形，少數(shù)有小角出現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)較MX組有極大改善；1.5μg/mL組細(xì)胞形態(tài)較MX組有稍微改善，仍有許多細(xì)胞出現(xiàn)了變形，但較MX組正常圓形細(xì)胞居多且角較??；15μg/mL組細(xì)胞形態(tài)比MX組和1.5μg/mL組較規(guī)則，細(xì)胞變形數(shù)量與細(xì)胞空泡減少；150μg/mL組細(xì)胞形態(tài)接近于正常情況，有少許的細(xì)胞空泡，細(xì)胞變形數(shù)目大為減少.結(jié)果顯示，冰片對(duì)LPS引起的RAW264.7細(xì)胞炎癥具有抗炎活性，且成劑量依賴性，抗炎活性大小為:150μg/mL>15μg/mL>1.5μg/mL，見(jiàn)圖3.

圖3 各組細(xì)胞形態(tài)圖（×200）

3.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子NO的含量變化

與KB組比較，MX組NO水平極顯著性升高（p<0.01），說(shuō)明LPS刺激RAW264.7細(xì)胞造模成功.與MX組比較，YX組、冰片低、中、高劑量組均能極顯著性降低上清液中NO水平，說(shuō)明均有抗炎效果.與1.5μg/mL組比較，15μg/mL、150μg/mL劑量下，NO水平均極顯著性降低（p<0.01），且150μg/mL濃度下NO水平降低幅度更大.綜上可知，冰片能劑量依賴性地降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO水平，見(jiàn)表1.

表1 各組NO含量變化（±s，n=6）

表1 各組NO含量變化（±s，n=6）

注:與KB組比較，*p<0.05，**p<0.01；與MX組比較，#p<0.05，##p<0.01；與1.5μg/mL組比較，★p<0.05，★★p<0.01.

組別NO（μmol/L）KB15.52±0.49 MX33.22±0.77**YX15.24±0.4094##1.5μg/mL28.84±0.68##15μg/mL24.70±0.91##★★150μg/mL16.42±0.59##★★

3.4 MAPKs通路、Nrf2通路及NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3.4.1 MAPKs通路p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK磷酸化水平變化

圖4 p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK磷酸化水平變化情況

Western blot結(jié)果顯示（圖4），與KB組比較，MX組經(jīng)LPS刺激后，p-p38、p-ERK和p-JNK磷酸化水平均極顯著性升高（p<0.01），表明細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功.而分別使用陽(yáng)性藥Dex和低、中、高濃度的冰片作用炎癥細(xì)胞后，p-p38、p-ERK和p-JNK磷酸化水平均出現(xiàn)不同程度地下降，表明冰片發(fā)揮了抗炎作用.其中，與MX組比較，YX組的p-p38、p-ERK和p-JNK磷酸化水平均顯著性下降（p<0.05，p<0.05，p<0.01）；而150μg/mL劑量下，p-p38、p-ERK和p-JNK磷酸化水平均極顯著性下降（p<0.01）；1.5μg/mL和15μg/mL的冰片部分組雖然沒(méi)有顯著性，但仍然可以看出均能抑制p-p38、p-ERK和p-JNK磷酸化水平.綜上表明，冰片可有效地抑制MAPKs通路的活化，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞抗炎活性.

3.4.2 Nrf2通路中Nrf2蛋白含量變化

Western blot結(jié)果顯示（圖5），與KB組比較，MX組Nrf2蛋白含量呈現(xiàn)應(yīng)激性的升高，且具有極顯著性差異（p<0.01），而分別使用陽(yáng)性藥Dex和低、中、高濃度的冰片作用細(xì)胞后，Nrf2蛋白含量出現(xiàn)不同程度地升高，表明冰片發(fā)揮了抗炎作用.與MX組比較，150μg/mL劑量下，Nrf2含量顯著性升高（p<0.05），而1.5μg/mL和15μg/mL組的含量升高不明顯（p>0.05）.綜上表明，冰片可劑量依賴性地激活Nrf2通路，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞的抗炎活性.

圖5 各組Nrf2蛋白變化情況

3.4.3 NF-κB通路p-p65/p65磷酸化水平變化

Western blot結(jié)果顯示（圖6），與KB組比較，MX組經(jīng)LPS刺激后，p-p65磷酸化水平明顯升高（p<0.05），表明細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功.而分別使用陽(yáng)性藥Dex和低、中、高濃度的冰片作用細(xì)胞后，p-p65磷酸化水平出現(xiàn)不同程度地下降，表明二者均發(fā)揮了抗炎作用.其中，與MX組比較，1.5μg/mL抑制p-p65磷酸化水平效果不明顯（p>0.05），15μg/mL和150μg/mL可極顯著性抑制p-p65磷酸化水平（p<0.01）.綜上表明，冰片可劑量依賴性地抑制NF-κB通路的活化，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞的抗炎活性.

圖6 p-p65/p65磷酸化水平變化情況

3.5 各組ROS表達(dá)變化情況

ROS增多會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，會(huì)對(duì)細(xì)胞或機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷，其含量的增高常被認(rèn)為是機(jī)體損傷的重要指標(biāo).如圖7所示，在LPS刺激下，MX組ROS表達(dá)率明顯升高（p＜0.01）.與MX組相比，藥物組ROS的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的極顯著性下降（p＜0.01），表明冰片對(duì)ROS有極顯著的抑制作用，且 150μg/mL與 15μg/mL效果均比1.5μg/mL效果好.綜上所述，冰片可劑量依賴性地抑制ROS的產(chǎn)生.

圖7 各組ROS表達(dá)水平

4 討論

NO作為炎癥反應(yīng)的重要炎性介質(zhì)，在炎癥、腫瘤等疾病進(jìn)程中均有重要作用［12-14］.iNOS是生成NO的一種關(guān)鍵酶，主要存在于巨噬細(xì)胞中，當(dāng)巨噬細(xì)胞遭受炎癥介質(zhì)、LPS等刺激時(shí)，誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶會(huì)顯著增加，從而產(chǎn)生大量的NO進(jìn)行免疫應(yīng)答.NO具有一定細(xì)胞毒性，會(huì)進(jìn)一步對(duì)機(jī)體造成損傷，從而促進(jìn)炎癥部位滲出和水腫［15］，抑制NO生成的程度是檢測(cè)抗炎活性的直接指標(biāo).本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與1.5μg/mL組比較，15μg/mL、150μg/mL劑量下，NO水平均極顯著性降低，且150μg/mL濃度下NO水平更低，說(shuō)明冰片能劑量依賴性地降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO水平，進(jìn)而發(fā)揮體外抗炎作用.

ROS屬于活性較高的自由基，是生物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥自由基等活性含氧化合物的總稱，是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵介質(zhì)，可激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞釋放大量炎性因子，其含量的多少是判斷是否發(fā)生氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)［16］.LPS可通過(guò)激活RAW264.7巨噬細(xì)胞上的toll樣受體-4復(fù)合物并引發(fā)全身性氧化應(yīng)激，從而致ROS水平顯著性增加［17］.而氧化應(yīng)激能夠調(diào)控和加劇炎癥，激活NF-κB和MAPKs炎癥通路，促進(jìn)炎性因子（如NO等）的表達(dá)，進(jìn)而會(huì)引起急性炎癥、組織損傷和敗血癥等［18］.本實(shí)驗(yàn)中藥物組ROS的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的下降，且150μg/mL組下降更顯著，表明冰片具有一定的抗炎作用.

NF-κB是細(xì)胞應(yīng)答損傷、應(yīng)力及炎癥的重要信號(hào)通路，參與多種炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，在炎癥反應(yīng)的復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中可能是一個(gè)中心環(huán)節(jié).NF-κB激活主要是由IKK（IκB激酶）激活而產(chǎn)生的.在受到外界刺激（如LPS）時(shí)，IκB被磷酸化，釋放出有活性的p50/p65二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)特異基因的轉(zhuǎn)錄［19］.活化的NF-κB能夠調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子NO等的合成以及分泌，進(jìn)而誘發(fā)炎癥的發(fā)生［20］.目前已證實(shí)該通路是抗炎藥物的重要作用靶點(diǎn)，阻斷或抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性可抑制炎癥反應(yīng).本實(shí)驗(yàn)采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞p65蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，冰片呈劑量依賴性地抑制RAW264.7細(xì)胞p65蛋白的磷酸化，即通過(guò)抑制NF-κB通路的激活，從而發(fā)揮抗炎作用.

MAPKs通路是能夠?qū)Ω鞣N細(xì)胞外刺激物做出應(yīng)答的經(jīng)典炎癥通路，通過(guò)應(yīng)答機(jī)體的各種刺激來(lái)激活促炎因子的表達(dá)，從而發(fā)揮應(yīng)激反應(yīng)的中心調(diào)節(jié)子作用［21］.胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、p38和c-Jun NH2-末端激酶（JNK）3條級(jí)聯(lián)反應(yīng)構(gòu)成MAPKs信號(hào)通路的主要部分，該通路的激活可促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的生成而加劇炎癥反應(yīng)［21］.現(xiàn)有研究顯示，MAPKs可被LPS激活［22］，活化成磷酸化狀態(tài)調(diào)控下游的炎性細(xì)胞因子［23］，抑制MAPKs通路的活化也是控制過(guò)度炎癥反應(yīng)的有效途徑［24］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，冰片可劑量依賴性地抑制MAPKs通路的活化，從而發(fā)揮細(xì)胞外抗炎作用.

另外，Nrf2蛋白在抗氧化反應(yīng)中起著重要的作用.在生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1結(jié)合，存在于細(xì)胞質(zhì)中.LPS通過(guò)一系列的信號(hào)分子激活Nrf2［25］，氧化應(yīng)激也能使之激活，促使其核轉(zhuǎn)位，與細(xì)胞核中的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，進(jìn)而激活抗氧化劑的轉(zhuǎn)錄基因［26］；Nrf2表達(dá)上調(diào)會(huì)抑制ROS的生成，從而抑制炎癥反應(yīng)［27］.因此，調(diào)節(jié)Nrf2蛋白對(duì)于抑制炎癥反應(yīng)和減輕氧化損傷具有重要的意義.本研究結(jié)果表明，冰片可劑量依賴性地激活Nrf2蛋白，其中150μg/mL抗炎效果較好.

綜上，冰片能劑量依賴性地抑制MAPKs和NF-κB通路的活化，激活Nrf2蛋白，抑制ROS的產(chǎn)生，降低相關(guān)炎癥因子NO的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞抗炎活性.此研究深化了對(duì)冰片的認(rèn)識(shí)，為冰片的合理用藥提供了理論基礎(chǔ).