miR-182在老年慢性心力衰竭病人循環(huán)中的表達(dá)及意義

多種微小RNA(microRNA,miR)在心臟中特異性表達(dá)或高表達(dá),且調(diào)控著心肌細(xì)胞的分化、肥大、增殖和凋亡等功能,其中miR-1、miR-133、miR-208、miR-499等認(rèn)為是心肌發(fā)育調(diào)控的重要參與者[1-3]。心力衰竭(心衰)是一系列心血管疾病的最終結(jié)果,在心衰進(jìn)展過(guò)程中的典型表現(xiàn)是心肌重構(gòu)和心肌間質(zhì)纖維化。miR-133、miR-21、miR-210、miR-499等多種miRNA在心衰時(shí)表達(dá)水平明顯增加,表明這些miRNAs參與了心臟病理性肥大及心衰的發(fā)生,從而可以成為有效的心衰生物標(biāo)記物[4-8]。本研究旨在觀察miR-182在老年慢性心衰病人循環(huán)中的表達(dá),以及不同心功能分級(jí)中miR-182表達(dá)水平的變化,探討miR-182在老年慢性心衰診斷及預(yù)后中的判斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年10月至2017年4月在我院住院符合Framinghan診斷標(biāo)準(zhǔn)的慢性心衰的老年病人94例(心衰組),參照美國(guó)紐約心臟病學(xué)會(huì)(NYHA)分級(jí),其中NYHAⅡ級(jí)32例,NYHAⅢ級(jí)32例,NYHA Ⅳ級(jí)30例。排除急性感染、自身免疫性疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤病人。并選取同期健康體檢老年人31例為對(duì)照組。本研究所有入選病人均簽署知情同意書,并經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(ZPYYLL-2015-23)。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料:專人測(cè)量身高、體質(zhì)量。全自動(dòng)生化儀測(cè)定血常規(guī)、肝腎功能、C反應(yīng)蛋白(CRP)。

1.2.2 N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)檢測(cè):空腹抽取靜脈血2 mL,肝素抗凝,采用電化學(xué)發(fā)光法自動(dòng)免疫儀檢測(cè)血漿NT-proBNP。

1.2.3 miR-182分析:采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)miR-182表達(dá)情況。以RNeasy Plus RNA試劑盒(QIAGEN公司)提取血漿總RNA,測(cè)定RNA濃度,對(duì)符合A260/A280 比值為1.8～2.0的總RNA才進(jìn)行下一步qRT-PCR反應(yīng)。以SuperScript Ⅲ試劑盒(Invitrogen公司)合成cDNA,以QuantiTect SYBR Green 試劑盒(QIAGEN公司)進(jìn)行qRT-PCR:cDNA稀釋10倍。miR-182的莖環(huán)引物序列:正向5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTG CACTGGATACGACAGTGTG-3′,反向5′-TTTGGCAATGGTAGAACTCA-3′。以U6為內(nèi)參,莖環(huán)引物序列:正向5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATT GCACTGGA TACGACAAAATATG-3′,反向5′-TTAGCATGGCCCCTGC-3′。采用386孔板20μL體系(2x SYB Green 10μL,稀釋后的cDNA 7μL,10μmol/L混合后的引物3μL)。50°C 2 min 1個(gè)循環(huán);95°C 10 min,1個(gè)循環(huán);95 °C 15 s、 60 °C 30 s、 72 °C 30 s,40個(gè)循環(huán);72°C 10 min,1個(gè)循環(huán)。于ABI 7900熒光 PCR儀進(jìn)行。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.4 超聲心動(dòng)圖檢查:采用美國(guó)HP5500型彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀,探頭頻率2.5 MHz,測(cè)定左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

2 結(jié)果

2.1 2組一般臨床資料比較 對(duì)照組與心衰組比較,年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)及白蛋白、血紅蛋白(Hb)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 血漿miR-182、NT-proBNP、CRP水平及LVEF比較 經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),miR-182、NT-proBNP、CRP、LVEF均不齊,予非參數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果顯示,心衰組血漿miR-182、NT-proBNP、CRP水平與對(duì)照組比較明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。心衰組LVEF與對(duì)照組比較明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1 2組一般臨床資料比較

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05

表2 2組循環(huán)miR-182、NT-proBNP、CRP水平及LVEF比較

注:與對(duì)照組比較,**P<0.01

2.3 相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示,miR-182與性別、BMI、CRP無(wú)相關(guān)關(guān)系(P>0.05),與年齡、BUN、Cr、NT-proBNP、心功能分級(jí)呈正相關(guān)(P<0.05),與白蛋白、Hb、LVEF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。NT-proBNP與年齡、BUN、Cr、CRP、心功能分級(jí)呈正相關(guān)(P<0.05),與BMI、白蛋白、Hb、LVEF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 心衰組miR-182、NT-proBNP與各指標(biāo)的相關(guān)分析

2.4 ROC曲線分析 miR-182診斷心衰的AUC為0.751,95%CI為0.658～0.843,敏感度為40.4%,特異度為93.5%。NT-proBNP診斷心衰的AUC為0.896,95%CI為0.843～0.949,最佳臨界值為618 ng/L,此點(diǎn)其敏感度為75.5%,特異度為100%。兩者AUC比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

老年慢性心衰病人癥狀和體征多為非特異性,且行動(dòng)不便不易配合外出檢查,早期確診有一定困難[9]。目前,臨床多通過(guò)檢測(cè)BNP/NT-proBNP來(lái)協(xié)助早期診斷慢性心衰。但BNP或NT-proBNP不僅在一些非心血管疾病中會(huì)升高,也受年齡、BMI、腎功能等影響。因此,我們一直在尋找相對(duì)更理想的生物學(xué)標(biāo)記物早期診斷老年慢性心衰。

miR-182屬于miR-183/96/182簇的一員,定位于人7號(hào)染色體,在多種細(xì)胞和組織中表達(dá),如成骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、視網(wǎng)膜、內(nèi)耳以及脂肪組織等[10-12]。miR-182可通過(guò)調(diào)節(jié)不同的靶mRNA對(duì)生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化發(fā)揮重要調(diào)控作用,尤其是在腫瘤的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13-14]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),miR-182在糖、脂代謝的調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用,其表達(dá)的紊亂可能會(huì)導(dǎo)致肥胖和糖尿病等代謝相關(guān)疾病以及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[15-16]。我國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn),miR-182通過(guò)抑制靶基因Racl可以抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[17]。心肌細(xì)胞肥大是心功能降低的主要結(jié)構(gòu)改變,由此可推測(cè)miR-182可能參與心衰的發(fā)生。之后的研究證實(shí)了這個(gè)推論。Cakmak等[18]通過(guò)微陣列分析不同NYHA分級(jí)(Ⅱ～Ⅳ)病人及健康對(duì)照人群的miRNA,結(jié)果顯示miR-182在心衰病人中明顯升高,進(jìn)一步分析ROC曲線的AUC,發(fā)現(xiàn)miR-182判斷心衰的預(yù)后方面優(yōu)于NT-proBNP及hs-CRP。我們的研究顯示,miR-182在心衰病人中的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照人群,進(jìn)一步行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)miR-182與NT-proBNP呈正相關(guān)(r=0.352,P<0.01)、與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.246,P<0.01),而且隨著心功能的下降逐漸升高(r=0.461,P<0.01),提示miR-182在心衰的診斷及預(yù)后判斷方面具有一定的價(jià)值。但是我們發(fā)現(xiàn),無(wú)論是與LVEF及心功能相關(guān)性的程度,還是在診斷心衰的敏感性、特異性,miR-182均不占優(yōu)勢(shì),這與Cakmak等[18]的研究結(jié)果并不一致。還需要更大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之,血漿miR-182表達(dá)水平對(duì)老年慢性心衰病人的診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)具有一定的臨床意義。與NT-proBNP相比較,miR-182同樣受年齡、腎功能、Hb、白蛋白影響,且特異性、敏感性不如NT-proBNP。但我們也認(rèn)識(shí)到,本研究受樣本數(shù)量較少、年齡跨度較大、未跟蹤隨訪等因素影響,可能導(dǎo)致本研究結(jié)論不全面,故今后尚需擴(kuò)大研究樣本量,并進(jìn)行跟蹤隨訪深入研究進(jìn)一步證實(shí)。