HPLC法測定箭根薯中薯蕷皂苷元的含量

西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 景洪 666100

箭根薯是傣醫(yī)常用藥之一，傣語稱咪火蛙，意譯為“味苦似牛膽”，為蒟蒻薯科蒟蒻薯屬植物箭根薯(TaccachantrieriAndre)的干燥塊莖(見圖1～2)。性味苦、涼，入水、風(fēng)塔。具有清火解毒，消腫止痛，排膿生肌，止咳化痰功效。用于瘡瘍腫毒，痄腮，乳癰，咽喉腫痛、咳嗽痰多，脘腹疼痛，解食毒[1]。箭根薯是傣藥雅解片、西雙版納州傣醫(yī)院制劑“解毒養(yǎng)顏膠囊”、“健胃止痛膠囊”、“五寶膠囊”處方藥材之一。箭根薯含有薯蕷皂苷元、豆甾醇、胡蘿卜甙、根薯酮內(nèi)酯類化合物[2-3]。據(jù)報(bào)道利用多種波譜技術(shù)從箭根薯的根及根莖中分離鑒定出10多個(gè)根薯酮內(nèi)酯類化合物[4]。薯蕷皂苷元 (Diosgenin)又名薯蕷皂素，是薯蕷皂苷的水解產(chǎn)物[5-6 ]；該化合物具有溶血、降血脂、抗菌、消炎、抗腫瘤作用[7-11]。目前，箭根薯藥材的標(biāo)準(zhǔn)收載于《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第一冊(cè)中，應(yīng)用HPLC法對(duì)其中薯蕷皂苷元的含量測定并未見報(bào)道。參考文獻(xiàn)[12-15]采用了HPLC法對(duì)其中薯蕷皂苷的水解產(chǎn)物薯蕷皂苷元進(jìn)行含量測定，建立箭根薯中薯蕷皂苷元含量測定方法，為箭根薯質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考方法和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀，T-214型電子天平(德國賽多利斯)，MS205DU型十萬分之一天平(梅特勒-托利多)。

1.2 材料 薯蕷皂苷元對(duì)照品(批號(hào)：111539-200001，中國食品藥品檢定研究院)使用前置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h后使用。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。箭根薯樣品采自西雙版納州景洪市和勐臘縣，經(jīng)西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所彭霞主任藥師鑒定為蒟蒻薯科蒟蒻薯屬植物箭根薯干燥塊莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相：乙腈-水(90∶ 10)；檢測波長：203 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按薯蕷皂苷元峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。薯蕷皂苷元峰與前后峰分離度應(yīng)大于1.5。在此色譜條件下，薯蕷皂苷元對(duì)照溶液色譜圖和供試品溶液色譜圖如圖3～4所示。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 取本品粉末2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，置具塞錐形瓶中，蒸干，殘?jiān)? mol/L鹽酸溶液25 mL使溶解，加熱回流1 h，取出，放至室溫，用石油醚(60～90℃)振搖提取4次，每次25 mL，合并石油醚(60～90℃)提取液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.3 方法學(xué)考察 按《中國藥典》2015年版四部“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”(通則9101)[16]的要求進(jìn)行方法驗(yàn)證。

2.3.1 線性關(guān)系考察 取濃度為671.6 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇配制得53.70、100.6、144.2、263.0、671.6 μg/mL的對(duì)照品溶液，搖勻。按上述色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。本品進(jìn)樣量在0.5370～6.716 μg的范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：Y=7.4659X-8.02026(r=0.9996)。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的供試品(批號(hào)：20130911)6份，分別按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照上述相同色譜條件測定，按干燥品計(jì)算，薯蕷皂苷元含量的RSD為1.2%(n=6)。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次的供試品溶液(批號(hào)：20130911)，在0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣測定，測得薯蕷皂苷元峰面積的RSD為0.65%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)：20130911)約1.0 g，分別加入6個(gè)具塞錐形瓶中，分別加入對(duì)照品約3.9 mg，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 樣品測定 按上述色譜條件測定，分別測定4個(gè)不同產(chǎn)地4批樣品，按干燥品計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 箭根薯中薯蕷皂苷元含量

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 用二極管陣列檢測器分析比較了薯蕷皂苷元對(duì)照品色譜峰和樣品所測成分相應(yīng)色譜峰的紫外光譜。試驗(yàn)證明，兩者的紫外光譜基本一致，均在203 nm處有一最大吸收峰，故選擇檢測波長為203 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇 在其他因素不變的情況下，比較不同比例的甲醇-水、乙腈-水-冰醋酸溶液、乙腈-水作為流動(dòng)相對(duì)測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以乙腈-水溶液(90∶ 10)作為流動(dòng)相，被測成分色譜峰拖尾因子和分離效果最好。因此，確定乙腈-水溶液(90∶ 10)為該分析方法的流動(dòng)相。

3.3 色譜拄溫度的選擇 在其他因素不變的情況下，比較不同色譜拄溫度(25℃、30℃、35℃)對(duì)測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)色譜拄溫度35℃時(shí)被測成分色譜峰拖尾因子和分離效果最好。因此，確定35℃為該分析方法的色譜柱溫度。

3.4 考察鹽酸濃度的選擇 取供試品(批號(hào)：20130911)，分別選用了2、3、4 mol/L鹽酸溶液進(jìn)行水解，結(jié)果三者測定值分別為3.74、3.92、3.93 mg/g，取3 mol/L鹽酸溶液時(shí)，已經(jīng)能水解完全，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，故選擇3 mol/L。

3.5 加熱回流提取時(shí)間考察 在其它條件不變的情況下，取供試品(批號(hào)：20130911)，分別進(jìn)行了0.5、1、2 h回流提取，結(jié)果三者測定值分別為3.61、3.92、3.91 mg/g，說明1 h已基本提取完全，考慮到經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本等因素，故選擇加熱回流提取時(shí)間為1 h。

3.6 水解時(shí)間考察 取供試品(批號(hào)：20130911)，選用了0.5、1.0、2.0 h進(jìn)行水解，結(jié)果三者測定值分別為1.92、3.94、3.91 mg/g，說明1 h已基本水解完全，考慮到經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本等因素，故選擇水解時(shí)間為1.0 h。

3.7 提取次數(shù)考察 取供試品(批號(hào)：20130911)，分別進(jìn)行了3、4、5次提取，結(jié)果三者測定值分別為3.55、3.93、3.94 mg/g，說明4次已基本提取完全，考慮到經(jīng)濟(jì)和人工成本等因素，故選擇提取次數(shù)為4次。

3.8 耐用性試驗(yàn) 《中國藥典》2015年版四部“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”(通則9101)[16]，規(guī)范了中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法，為了進(jìn)一步驗(yàn)證“HPLC測定箭根薯中薯蕷皂苷元含量”方法的可靠性，筆者參照該指導(dǎo)原則以測定方法進(jìn)行了驗(yàn)證。為了給本方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)，對(duì)其耐用性試驗(yàn)進(jìn)一步探討，考察了隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響。考察了不同色譜柱：Agilent XDB-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)；InertSustain C18 (5 μm, 250 mm×4.6 mm)；資生堂MGⅡ C18(5 μm,150 mm×4.6 mm)、不同檢測波長(201 nm、203 nm、205 nm)。結(jié)果基本一致，進(jìn)一步確保了試驗(yàn)方法的科學(xué)性及數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，為箭根薯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了科學(xué)依據(jù)。箭根薯的同屬植物裂果薯發(fā)現(xiàn)較好的抗癌活性[17-19]，目前對(duì)箭根薯研究報(bào)道較少，希望此研究為今后箭根薯的進(jìn)一步研究、應(yīng)用、開發(fā)提供參考。