銅綠假單胞菌280株基因分型及耐藥性分析

陶春梅，龔雅利

作者單位：1重慶市沙坪壩區(qū)陳家橋醫(yī)院檢驗科，重慶 401331；2第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷研究所，重慶 400038

銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，也是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一。在免疫力低下或缺失、肺囊性纖維化以及燒傷病人中的感染尤為常見［1-2］。近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對抗菌藥物的耐藥率日益攀升，多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）及廣泛耐藥（extensively drug resistant，XDR）菌株的分離率不斷升高，為臨床感染的控制和治療帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)［3］。根據(jù)2016年全國耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率達(dá)到了25%以上。不僅在中國，多耐藥銅綠假單胞菌在全球亦呈現(xiàn)出廣泛流行和傳播的特點，成為重要的全球性的公共衛(wèi)生問題［3］。因此有必要對臨床感染的銅綠假單胞菌進(jìn)行定期的流行病學(xué)監(jiān)測及耐藥性分析，從而幫助我們了解細(xì)菌的親緣關(guān)系、傳播途徑以及耐藥特點，確認(rèn)是否存在暴發(fā)或交叉感染，以便制定有效的防控措施。

在本研究中，我們對280株銅綠假單胞菌進(jìn)行了ERIC-PCR分型及耐藥性分析，并檢測了35株碳青霉烯不敏感菌株中12種主要的碳青霉烯酶基因（blaIMP，blaVIM，blaNDM，blaGES，blaSPM，blaOXA-48，blaBIC，blaKPC，blaAIM，blaGIM，blaSIM，blaDIM）的攜帶情況，探討細(xì)菌的型別分布及耐藥變遷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 280株銅綠假單胞菌分離自2011年6月至2017年7月重慶市沙坪壩區(qū)陳家橋醫(yī)院住院病人，所有菌株經(jīng)API 20NE系統(tǒng)（非腸道革蘭陰性桿菌鑒定系統(tǒng)）鑒定為銅綠假單胞菌。

1.1.2主要儀器和試劑 生化鑒定系統(tǒng)（API 20NE，法國BioMerieux）；PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad）；電泳儀（美國Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）；藥敏檢測紙片（英國Oxoid）；LB培養(yǎng)基（英國Oxoid）。

1.2 方法

1.2.1菌株的分離鑒定 按常規(guī)方法分離采集菌株，均采用API 20NE生化鑒定系統(tǒng)分析鑒定。

1.2.2ERIC-PCR分型 取各菌株菌液煮沸10 min后5 000g離心，吸取上清作為PCR擴(kuò)增模板。以ERIC1：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’和ERIC2：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’為引物（上海生工合成）［4］，用2×Fast Taq酶（Novoprotein）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性7 min，95℃變性1 min，52℃退火1 min，62℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后62℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。應(yīng)用Quantity one軟件對獲得的指紋圖譜進(jìn)行識別提取，最后采用非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類分析。以相似度≥0.8作為同一基因型，＜0.8為不同基因型。

1.2.3藥敏試驗 應(yīng)用K-B擴(kuò)散法鑒定哌拉西林（PIP）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）、替卡西林/棒酸（TIM）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢吡肟（FEP）、氨曲南（ATM）、亞胺培南（IMP）、美羅培南（MEM）、阿米卡星（AMK）、慶大霉素（GEN）、妥布霉素（TOB）、左氧氟沙星（LVX）、環(huán)丙沙星（CIP）等抗生素的敏感性，判定方法參考細(xì)菌分離當(dāng)年的CLSI（美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會）標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4碳青霉烯酶基因檢測 按上述PCR模板制備方法，取碳青霉烯不敏感菌株35株中12對主要的碳青霉烯酶基因（blaIMP，blaVIM，blaNDM，blaGES，blaSPM，blaOXA-48，blaBIC，blaKPC，blaAIM，blaGIM，blaSIM，blaDIM）的引物，以2×Fast Taq酶進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，引物及方法參見相關(guān)文獻(xiàn)［5］。擴(kuò)增體系及條件如下：模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Fast Taq酶5 μL，去離子水3 μL。94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株標(biāo)本來源及病房分布本研究一共統(tǒng)計了分離的280株銅綠假單胞菌，同一病人選取首次分離菌。標(biāo)本來源以痰液標(biāo)本最多，為262株（93.6%）。其他標(biāo)本來源依次為傷口分泌物9株（3.2%）、膿液3株（1.0%）、組織液2株（0.7%）、血液2株（0.7%）、穿刺液1株（0.4%）、尿液1株（0.4%）。280株細(xì)菌的病房分布以內(nèi)一科（呼吸內(nèi)科、消化內(nèi)科）居多，共179株（63.9%），其次是ICU共36株（12.9%），其余病房依次為兒科21株（7.5%）、內(nèi)二科（心血管內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科）18株（6.4%）、外一科（骨科）13株（4.6%）、外二科（普外科）8株（2.9%）、門診4株（1.4%）、婦產(chǎn)科1株（0.4%）。

2.2 ERIC-PCR分型280株銅綠假單胞菌通過ERIC-PCR分型及聚類分析后，以相似度≥0.8作為同一基因型分型，所有細(xì)菌可以分為17種型別，分別命名為A（42株）、B（1株）、C（4株）、D（16株）、E（18株）、F（16株）、G（47株）、H（43株）、I（22株）、J（20株）、K（8株）、L（24株）、M（1株）、N（8株）、O（7株）、P（2株）、Q（1株）型，見圖1。

其中A、G、H三種為主要型別，分別有42株、47株和43株。A、G、H三種型別在幾個主要的科室如內(nèi)一科（呼吸內(nèi)科、消化內(nèi)科）、ICU、兒科、內(nèi)二科（心血管內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科）、外一科（骨科）、外二科（普外科）均有分布。其余型別散在分布于各個科室。

圖2為典型的ERIC-PCR產(chǎn)物電泳圖，箭頭所示依次為A、G、H三種主要型別的指紋圖譜。

2.3 藥敏試驗結(jié)果藥敏試驗共測試了13種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)分為敏感、中介和耐藥。細(xì)菌對各種抗生素的敏感性分別為哌拉西林（PIP，82.9%）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP，90.4%）、替卡西林/棒酸（TIM，80.4%）、頭孢他啶（CAZ，81.1%）、頭孢吡肟（FEP，86.8%）、氨曲南（ATM，88.6%）、亞胺培南（IMP，89.6%）、美羅培南（MEM，92.9%）、阿米卡星（AMK，94.6%）、慶大霉素（GEN，90.7%）、妥布霉素（TOB，95.4%）、左氧氟沙星（LVX，86.4%）、環(huán)丙沙星（CIP，87.5%）。

2.4 碳青霉烯類抗生素耐藥趨勢分析該院6年間銅綠假單胞菌亞胺培南和美羅培南的總不敏感率（亞胺培南或美羅培南不敏感菌株數(shù)/菌株總數(shù)）分別為10.4%（29/280）和7.1%（20/280），其中，2011年6月至2017年7月各年份分離菌株對亞胺培南的不敏感 率 分 別 為 5.5%、5.4%、7.1%、10.6%、13.2%、12.2%、14.7%，而對美羅培南的不敏感率分別為5.5%、2.7%、2.3%、6.3%、9.4%、10.2%、11.7%。表明該院分離的銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率有逐年升高的趨勢。見圖3。

圖3 2011年6月至2017年7月分離銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的不敏感率

2.5 碳青霉烯酶的攜帶檢測結(jié)果分析通過PCR檢測35株碳青霉烯類抗生素不敏感菌株的碳青霉烯酶的攜帶情況，結(jié)果表明僅IMP和VIM兩種酶編碼基因有檢出，攜帶率分別為8.57%（3/35）和5.71%（2/35）。 其 余 基 因 blaNDM，blaGES，blaSPM，blaOXA-48，blaBIC，blaKPC，blaAIM，blaGIM，blaSIM，blaDIM均未發(fā)現(xiàn)陽性表達(dá)。

3 討論

銅綠假單胞菌是引起醫(yī)院感染的重要的條件致病菌，由于耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，對其臨床感染的治療和耐藥機(jī)制的研究一直備受關(guān)注。不同于其他細(xì)菌單一的克隆傳播，銅綠假單胞菌往往呈現(xiàn)出多樣性的遺傳背景，而基因型別的多樣性使其更容易獲得耐藥性或者其他遺傳優(yōu)勢，導(dǎo)致其毒力增強(qiáng)，感染能力增加［6］。本研究中，從標(biāo)本來源和科室分布來看，絕大部分標(biāo)本來自于痰液，呼吸內(nèi)科和ICU病房分離率最高，說明在我院銅綠假單胞菌多來源于肺部感染的內(nèi)科病人，該群體應(yīng)該成為銅綠假單胞菌防控的重點。ERIC-PCR分型的結(jié)果顯示我院分離的銅綠假單胞菌呈現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，與國內(nèi)各地區(qū)醫(yī)院流調(diào)報道基本一致［7-9］。但基因分型以A、G、H三種主要型別為主，且在大多數(shù)科室均有分布，表明這三種型別是我院流行的優(yōu)勢型別，應(yīng)加強(qiáng)對這些主要型別的監(jiān)測，控制其在病區(qū)間的傳播，降低醫(yī)院感染的發(fā)生率。此外，各個科室的型別組成也有一定的差異。這種差異可能是由于各個科室抗生素使用習(xí)慣不同所致，不同的選擇壓力導(dǎo)致了不同型別的感染和流行。但ERIC-PCR也存在一定的局限性，與脈沖場凝膠電泳及多位點序列分型相比，ERIC-PCR的分型結(jié)果很難進(jìn)行橫向比較，只能反映局部地區(qū)流行細(xì)菌的親緣關(guān)系。

隨著抗生素的廣泛使用，銅綠假單胞菌對大多數(shù)臨床常用抗生素的敏感性不斷下降，多耐藥和廣泛耐藥細(xì)菌分離率日益增高。碳青霉烯類抗生素是治療多耐藥銅綠假單胞菌常用且有效的抗菌藥物之一，其耐藥率也在不斷攀升［10］。但各地銅綠假單胞菌的碳青霉烯耐藥率也有所差異，在歐洲各國，碳青霉烯類抗生素不敏感率大多在10%～30%不等，但希臘達(dá)到了50.5%［11］。美國研究機(jī)構(gòu)所提供的數(shù)據(jù)顯示亞胺培南耐藥率為21.9%，美羅培南耐藥率為15.4%［12］。中國2016年全國耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為28.7%和25.3%。而本研究中，我院6年來銅綠假單胞菌對亞胺培南和美羅培南的平均不敏感率分別為10.4%和7.1%。與其他檢測的大多數(shù)抗生素一樣，我院所分離的銅綠假單胞菌的耐藥率顯著低于全國耐藥數(shù)據(jù)。其可能原因是由于全國耐藥數(shù)據(jù)所統(tǒng)計的大多數(shù)細(xì)菌來自于全國三級甲等以上的醫(yī)院所致。但從不同年份的耐藥情況來看，碳青霉烯類抗生素的耐藥率仍在逐年升高。因此，盡管可能在基層醫(yī)院碳青霉烯的耐藥率較低，但其逐年升高的趨勢也不容忽視，抗生素合理有效的使用仍應(yīng)引起臨床工作者的足夠重視。

銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，目前報道的主要包括攜帶碳青霉烯酶，孔蛋白OprD的突變或表達(dá)抑制，以及外排泵系統(tǒng)高表達(dá)［13］。在本研究中，我們只檢測了碳青霉烯酶的攜帶情況，結(jié)果表明檢測菌株中主要攜帶IMP和VIM兩種常見的碳青霉烯酶基因，但陽性率較低。既往文獻(xiàn)報道也顯示，與歐美國家相比，國內(nèi)流行的銅綠假單胞菌碳青霉烯酶攜帶率較低［7，14］。oprD基因突變和外排泵高表達(dá)是國內(nèi)菌株耐碳青霉烯的主要機(jī)制［15］。

綜上，本研究調(diào)查了我院2011年至2017年六年中銅綠假單胞菌的總流行情況，分析發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌多來源于內(nèi)科肺部感染病人，存在A、G、H三種主要型別。細(xì)菌對碳青霉烯酶類抗生素的耐藥率雖逐年升高，但仍低于全國耐藥監(jiān)測網(wǎng)所提供的數(shù)據(jù)，且細(xì)菌碳青霉烯酶基因攜帶率較低。

（本文圖1，2見插圖5-6）

圖1 銅綠假單胞菌280株ERIC-PCR分型結(jié)果

圖2 銅綠假單胞菌280株ERIC-PCR分型典型電泳圖