p53、p21、MDM2蛋白在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥病人血清、異位及在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)及相關(guān)性

侴琳，王慧，趙曉麗

作者單位：鄭州人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450000

子宮內(nèi)膜異位癥主要是指在子宮腔被覆黏膜之外身體其他部位（子宮肌層除外）出現(xiàn)子宮內(nèi)膜組織（具有生長(zhǎng)功能），其主要分布在盆腔內(nèi)生殖器官或鄰近器官腹膜面，其中以卵巢為多見，稱卵巢子宮內(nèi)膜異位癥。近年來(lái)，有研究顯示，子宮內(nèi)膜異位癥屬于雌激素依賴性疾病，其發(fā)生與局部組織細(xì)胞因子表達(dá)異常及免疫有關(guān)［1］。p53蛋白屬于一種腫瘤抑制因子，在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中起著重要作用，p21則為p53的誘導(dǎo)基因，在細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期中發(fā)揮作用。MDM2是調(diào)節(jié)p53的重要基因，其作用和p53有密切相關(guān)性。這些蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥病人血清中表達(dá)情況臨床研究較少，子宮內(nèi)膜異位癥病人在位內(nèi)膜表達(dá)的研究也甚少。至此，本研究探討p53、p21、MDM2在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥病人血清及異位、在位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料采用隨機(jī)數(shù)字表法選取2012年1月至2017年3月在鄭州人民醫(yī)院收治的卵巢子宮內(nèi)膜異位癥病人50例的異位子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本（異位組）。所有病人無(wú)內(nèi)科并發(fā)癥、臨床資料完整、術(shù)前6個(gè)月內(nèi)無(wú)激素治療，且均經(jīng)腹腔鏡或開腹術(shù)切除后病理確診：根據(jù)1985年美國(guó)生育學(xué)會(huì)修訂的AFS-r分期法［2］進(jìn)行分期：Ⅰ期（1～5分）12例，Ⅱ期（6～15分）16例，Ⅲ期（16～40分）18例，Ⅳ期（＞40分）4例。根據(jù)月經(jīng)周期和HE染色組織切片可知，入選病例中分泌期23例，增生期27例。年齡范圍為25～46歲，年齡（40.24±7.10）歲。另選取同期子宮內(nèi)膜異位癥病人自愿刮宮術(shù)取得的在位子宮內(nèi)膜組織40例作為在位組，刮宮術(shù)取得的非子宮內(nèi)膜異位癥病人的正常子宮內(nèi)膜組織35例作為對(duì)照組。在位組中分泌期18例，增生期22例，年齡范圍為28～48歲，年齡（41.44±7.56）歲。對(duì)照組中分泌期15例，增生期20例，年齡范圍為30～52歲，年齡（42.24±7.26）歲。異位組與在位組病人共90例，作為觀察組。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。入選者知情同意。各組年齡、分泌期例數(shù)、增生期例數(shù)等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1內(nèi)膜組織檢測(cè) 主要試劑：鼠抗人MDM2蛋白單克隆抗體（一抗工作液濃度1∶100，批號(hào)20161011）、鼠抗人p21蛋白單克隆抗體（一抗工作液濃度1∶100，批號(hào)20160321）及鼠抗人p53單克隆抗體（一抗工作液濃度1∶100，批號(hào)20160825），均由奧維亞生物有限公司提供；免疫組化染色法（S-P）試劑盒，由普建生物（武漢）有限公司提供。方法：選取的標(biāo)本經(jīng)過(guò)甲醛（10%）固定后，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度4 μm），染色用HE及免疫組化法，具體步驟根據(jù)試劑盒中說(shuō)明書進(jìn)行。染色后由專業(yè)病理醫(yī)師進(jìn)行確診。

1.2.2血清檢測(cè) 觀察組在術(shù)前取晨靜脈血2 mL，離心、取上清入EP管中，置于-80℃冰箱中備用。用ELISA法進(jìn)行血清p53、p21、DMD2水平檢測(cè)，對(duì)照組在體檢時(shí)抽取晨靜脈血2 mL進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒由武漢伊萊瑞特公司提供，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書由檢驗(yàn)科專人操作。

1.3 結(jié)果評(píng)定著色定位在細(xì)胞核中，呈現(xiàn)黃或棕黃色顆粒，為p53、p21陽(yáng)性；著色定位在細(xì)胞核及其胞質(zhì)中，呈現(xiàn)黃或棕黃色顆粒，為MDM2蛋白陽(yáng)性。隨機(jī)在100倍的高倍鏡下選取10個(gè)視野，1 000個(gè)細(xì)胞，按照陽(yáng)性細(xì)胞占的百分比（80%為4，51%～80%為3，50%～10%為2，10%以內(nèi)為1，0%為0）及染色強(qiáng)度（棕褐色為3，棕黃色為2，淡黃色為1，無(wú)色為0）對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以二者乘積＞3表示為陽(yáng)性。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用及SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。蛋白表達(dá)率比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料用±s表示，比較采用成組t檢驗(yàn)，用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 三組p53、p21、MDM2表達(dá)分析異位組p53、p21表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組及在位組（P＜0.05）；異位組MDM2表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組及在位組（P＜0.05）；在位組與對(duì)照組比較，p53、p21、MDM2表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1～7，表1。

表1 刮宮術(shù)子宮內(nèi)膜組織（在位組及對(duì)照組）和手術(shù)取得的異位子宮內(nèi)膜組織（異位組）中p53、p21、MDM2表達(dá)比較

2.2 三組分泌期及增生期p53、p21、MDM2表達(dá)分析對(duì)照組、在位組分泌期p53、p21表達(dá)均明顯高于組內(nèi)增生期（P＜0.05），對(duì)照組、在位組、異位組分泌期MDM2表達(dá)陽(yáng)性率與組內(nèi)增生期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 刮宮術(shù)子宮內(nèi)膜組織（在位組及對(duì)照組）和手術(shù)取得的異位子宮內(nèi)膜組織（異位組）中分泌期及增生期p53、p21、MDM2表達(dá)分析

2.3 子宮內(nèi)膜異位癥病人異位子宮內(nèi)膜組織中p53、p21、MDM2表達(dá)相關(guān)性分析子宮內(nèi)膜異位癥病人異位子宮內(nèi)膜病理組織中p53表達(dá)與p21表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.721，P＜0.01）；p53表達(dá)與MDM2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.421，P＜0.01）；p21表達(dá)與MDM2表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r＝0.308，P＞0.05），見表3～5。

表3 子宮內(nèi)膜異位癥病人異位子宮內(nèi)膜組織中p53表達(dá)與p21相關(guān)性分析/例

表4 子宮內(nèi)膜異位癥病人異位子宮內(nèi)膜組織中p53表達(dá)與MDM2表達(dá)相關(guān)性分析/例

表5 子宮內(nèi)膜異位癥病人異位子宮內(nèi)膜組織中p21表達(dá)與MDM2表達(dá)相關(guān)性分析/例

2.4 兩組血清p53、p21、MDM2水平比較觀察組血清p53、p21水平明顯低于對(duì)照組，MDM2水平明顯高于對(duì)照組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表6。

表6 子宮內(nèi)膜異位癥病人血清p53、p21、MDM2水平比較/（kU/L，±s）

表6 子宮內(nèi)膜異位癥病人血清p53、p21、MDM2水平比較/（kU/L，±s）

組別對(duì)照組觀察組t值P 值例數(shù)35 90 p53 1.38±0.19 0.86±0.23 11.883 0.000 p21 1.68±0.24 1.04±0.12 19.795 0.000 MDM2 1.03±0.15 2.19±0.33 19.971 0.000

3 討論

p53基因及其蛋白均與細(xì)胞周期的調(diào)控及凋亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡主要指機(jī)體為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，消除衰老、多余及受損的細(xì)胞。于玲、田永杰［3］研究顯示，正常的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡主要呈周期性變化，表現(xiàn)為內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡率在經(jīng)期、分泌晚期比增殖期、分泌早期有明顯升高。此種周期性凋亡是子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及功能維持正常的關(guān)鍵。p21屬于CDI（細(xì)胞周期依賴性激酶抑制蛋白）家族的成員，在G1期中對(duì)細(xì)胞周期有負(fù)調(diào)控作用。哈春芳等［4］研究顯示，p21蛋白表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌及子宮內(nèi)膜增生組織中明顯減少或無(wú)表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，正常子宮內(nèi)膜組織及在分泌期p53、p21表達(dá)水平均高于增生期，和上面的研究一致。而子宮內(nèi)膜異位癥病人異位子宮內(nèi)膜組織的p53、p21表達(dá)水平在分泌期及增生期差異不明顯，由此提示，在子宮內(nèi)膜異位癥組織中，細(xì)胞凋亡失去正常的周期變化，和正常子宮內(nèi)膜組織比較，p53、p21在分泌期表達(dá)下降，而在增殖期相對(duì)增加，在其他子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的因素共同作用下，使異位癥病灶繼續(xù)發(fā)生及發(fā)展。本研究結(jié)果還證明，子宮內(nèi)膜異位癥病人在位子宮內(nèi)膜組織的分泌期p53、p21表達(dá)水平均高于增生期，和對(duì)照組差異不明顯，由此說(shuō)明在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡仍保持正常的周期變化。這也是本研究創(chuàng)新之處。本研究中還探討了子宮內(nèi)膜異位癥病人術(shù)前血清相關(guān)蛋白情況，結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥病人術(shù)前血清p53、p21水平明顯低于對(duì)照組，MDM2水平明顯高于對(duì)照組，由此提示，進(jìn)行血清p53、p21及MDM2水平檢測(cè)對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥輔助診斷有一定的意義［5］，此結(jié)果仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

MDM2屬于一種癌基因，對(duì)細(xì)胞的生存能力有促進(jìn)作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖及腫瘤生長(zhǎng)。本研究中顯示，卵巢子宮內(nèi)膜異位癥組織中表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，由此提示子宮內(nèi)膜異位癥病人異位子宮內(nèi)膜組織中MDM2表達(dá)明顯升高，引起正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞周期及功能發(fā)生紊亂，促使子宮內(nèi)膜異位癥的形成和發(fā)展。但不管是正常子宮內(nèi)膜組織還是異位子宮內(nèi)膜組織的分泌期、增生期，MDM2表達(dá)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能和本研究樣本量小有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究［6］。

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)較復(fù)雜的過(guò)程，已有研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡異常在其中起著非常重要的作用［7-8］。細(xì)胞凋亡主要受多種基因的調(diào)控而完成，凋亡抑制基因缺失及凋亡促進(jìn)基因過(guò)量共同作用，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展。已有文獻(xiàn)顯示，p53、p21這兩種促凋亡因子在細(xì)胞的凋亡作用中呈一定的相關(guān)性［9-10］。p53能夠誘導(dǎo)p21的表達(dá)，而p21基因的啟動(dòng)子區(qū)有p53的結(jié)合位點(diǎn)，細(xì)胞DNA有損傷后，p21在p53的誘導(dǎo)下呈明顯升高，抑制CDK的活性，使細(xì)胞停止在G1期。本研究結(jié)果顯示，p53和p21呈正相關(guān)，在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中相互影響，相互協(xié)同。MDM2蛋白屬于p53的負(fù)控蛋白，本研究結(jié)果顯示，這兩種蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中互相影響和制約。本研究結(jié)果還顯示，MDM2和p21表達(dá)在子宮內(nèi)膜異位癥中無(wú)相關(guān)性，這可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)不同途徑發(fā)揮的作用［11］。

綜上所述，p53、p21、MDM2蛋白表達(dá)在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，且它們之間存在一定相關(guān)性。

（本文圖1～7見插圖5-4）

圖1 卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜（HE×100） 圖2 p53在異位內(nèi)膜組織中陽(yáng)性表達(dá)（SB×100） 圖3 p21在異位內(nèi)膜組織中陽(yáng)性表（SB×100）圖4 MDM2在異位內(nèi)膜組織中陽(yáng)性表達(dá)（SB×100） 圖5 刮宮術(shù)子宮內(nèi)膜組織（在位組及對(duì)照組）和手術(shù)取得的異位子宮內(nèi)膜組織（異位組）中p53陽(yáng)性表達(dá)率、陰性表達(dá)率比較（與在位組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05；與對(duì)照組比較，cP＞0.05） 圖6 刮宮術(shù)子宮內(nèi)膜組織（在位組及對(duì)照組）和手術(shù)取得的異位子宮內(nèi)膜組織（異位組）中p21陽(yáng)性表達(dá)率、陰性表達(dá)率比較（與在位組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05；與對(duì)照組比較，cP＞0.05） 圖7 刮宮術(shù)子宮內(nèi)膜組織（在位組及對(duì)照組）和手術(shù)取得的異位子宮內(nèi)膜組織（異位組）中MDM2陽(yáng)性表達(dá)率、陰性表達(dá)率比較（與在位組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05；與對(duì)照組比較，cP＞0.05）