桂枝茯苓膠囊對模型大鼠子宮肌瘤中孕激素受體及子宮平滑肌細胞的影響

范華農，龔義鳳

作者單位：1浠水縣中醫(yī)院婦產科，湖北 黃岡 438200；2繁昌縣中醫(yī)院婦產科，安徽 蕪湖 242400

子宮肌瘤又稱子宮平滑肌瘤，由平滑肌及結締組織組成，是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤，育齡期婦女平均發(fā)病率約為77%，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢［1-2］。其常引起月經(jīng)過多、不孕、流產等疾病，也是女性子宮切除的常見原因，嚴重影響病人身心健康。據(jù)相關文獻報道，雌、孕激素是子宮肌瘤形成發(fā)展的重要因素，且與雌、孕激素受體（ER、PR）有很重要的聯(lián)系，還與子宮平滑肌細胞蛋白激酶C（PKC）關系密切。PKC是調節(jié)平滑肌細胞收縮、受體結合、細胞增殖分化的信號傳遞通道的重要物質，其降低有促進體外培養(yǎng)的子宮平滑肌瘤細胞生長抑制的作用，桂枝茯苓膠囊由桂枝、茯苓、牡丹皮等中藥組成，具有活血化瘀，緩消癥塊之效。臨床應用于子宮肌瘤療效顯著［3］。筆者通過觀察PR和PKC對造模大鼠子宮肌瘤的表達影響，進一步探析桂枝茯苓膠囊對子宮肌瘤的作用機制。

本研究起止時間為2016年1月至2017年1月。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物及試劑桂枝茯苓流浸膏：桂枝茯苓膠囊（成分相同）（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產，濃度0.31 g/mL，批號20160507）用量按成人與大鼠等效用量換算而成。米非司酮片：每片25 mg（北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號43181709）配制成濃度為0.27 mg/mL的溶液備用（溶于丙二醇中）。黃體酮注射液：20 mg/mL（浙江仙琚藥業(yè)，批號021603）。苯甲酸雌二醇注射液：2 mg/mL（天津金耀氨基酸藥業(yè)，批號021865）。PR單克隆抗體（德國Biometro公司）。儀器：Leica熒光倒置顯微鏡（上海洛豐精密檢測儀器有限公司）；Thermo-CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司）；SP試劑盒（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 動物分組SPF級Wistar雌性大鼠體質量范圍180～220 g，共81只，采用隨機數(shù)字表法分為正常組14只，造模組67只。本研究符合一般實驗動物倫理學原則。

1.3 造模方法正常組：14只，肌注0.9%生理鹽水0.05 mL（3次/周）；造模組：67只，肌注苯甲酸雌二醇0.06 mL（含藥量0.12 mg，3次/周），同時肌注黃體酮0.05 mL（含藥量1 mg，1次/周）；共16周。造模過程中正常組1只丟失，造模組2只丟失及6只意外死亡，造模結束時正常組共13只，造模組共59只。

1.4 給藥方法造模組59只模型大鼠分為三組：模型組17只，桂枝茯苓組21只，米非司酮組21只。每只模型組大鼠每天灌服0.9%生理鹽水2 mL，其他兩組每只大鼠每天分別灌服桂枝茯苓流浸膏或米非司酮溶液2 mL，共灌服12周（用量按成人與大鼠等效用量換算而成）。灌胃時間較長，結束時大鼠死亡11只，剩余正常組13只，模型組16只，桂枝茯苓組17只，米非司酮組15只。

1.5 觀測指標大鼠在灌胃第12周時，取大鼠子宮組織放入甲醛溶液中固定，觀察大鼠子宮各項指標并用SP法檢測各組子宮平滑肌組織的PR，免疫組化法計算各組PKC的活性。

1.6 免疫組化方法（1）孕激素受體染色流程：標本切片脫蠟水化→甲醇處理切片→水洗、PBS洗→加血清孵→PR單抗放置過夜→PBS洗→加入SP復合物孵育→PBS洗→鏈霉卵白素孵→PBS洗→DAB-孵育→PBS洗，水洗→Harris蘇木素復染→水洗→分化，藍化，脫水封片。

（2）PKC提?。喝〈笫笞訉m平滑肌細胞→緩沖液孵15 min→粉碎細胞→離心→上清液為細胞質PKC提取物→沉淀→離心→胞膜PKC提取物（上清液）。

1.7 結果判定（1）切片中不同高倍視野細胞計數(shù)共1 000個，得出陽性率，細胞核中棕黃色顆粒為孕激素受體陽性染色，其中無陽性細胞以（－）表示；陽性染色細胞＜25%（+）；25%＜陽性染色細胞＜50%（++），陽性染色細胞＞50%（+++）。

（2）將PKC加入到含有組蛋白、γ-32 P-ATP和磷脂酰絲胺酸的緩沖液中，溫浴30 min，30℃，用γ-閃爍計數(shù)儀檢測放射性，計算PKC的活性（PKC活性單位：fmol·mg-1min-1）。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析+HSD-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠質量、子宮質量及子宮系數(shù)差異比較本實驗研究參照相關文獻資料［3-4］改進后建立子宮肌瘤模型。監(jiān)測模型大鼠質量、子宮質量、子宮系數(shù)（即子宮質量/大鼠質量），其結果均明顯大于正常組大鼠（P＜0.05）；而用藥組大鼠質量、子宮質量、子宮系數(shù)低于模型組（P＜0.05）；桂枝茯苓組大鼠質量、子宮質量、子宮系數(shù)與米非司酮組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠質量、子宮質量和子宮系數(shù)/±s

表1 各組大鼠質量、子宮質量和子宮系數(shù)/±s

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別正常組模型組桂枝茯苓組米非司酮組F值P值鼠數(shù)13 16 17 15鼠質量/g 185.2±19.8 348.3±50.3a 335.2±46.5ab 325.7±30.2ab 50.39 0.000子宮質量/mg 1.43±0.56 4.67±1.31a 3.55±0.73ab 3.50±0.82ab 30.74 0.000子宮系數(shù)/%0.77±0.12 1.34±0.11a 1.06±0.51b 1.07±0.48b 5.736 0.002

2.2 各組大鼠子宮平滑肌組織中PR陽性率及平滑肌細胞PKC的表達差異比較模型組大鼠子宮平滑肌組織細胞核中PR的陽性率、細胞膜PKC的活性均極顯著高于正常組（P＜0.05），細胞質PKC的活性低于正常組（P＜0.05）。

用藥后，PR陽性表達率，桂枝茯苓組與模型組比較下降極其顯著（P＜0.05），米非司酮組與模型組比較下降顯著（P＜0.05），桂枝茯苓組下降更明顯接近正常組水平（P＞0.05）。

PKC細胞膜的活性表達，桂枝茯苓組與模型組比較下降極其顯著（P＜0.05），米非司酮組細胞膜的活性下降不明顯與模型組相比較多差異無統(tǒng)計學意義，桂枝茯苓組更接近正常組。

PKC細胞質的活性表達，桂枝茯苓組與模型組比較升高明顯（P＜0.05），桂枝茯苓組PKC細胞質的活性升高多接近正常組表達；米非司酮組與模型組比較升高不明顯。見表2。

表2 各組大鼠子宮平滑肌PR陽性率及平滑肌細胞PKC活性表達/± s

表2 各組大鼠子宮平滑肌PR陽性率及平滑肌細胞PKC活性表達/± s

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別正常組模型組桂枝茯苓組米非司酮組F值P值鼠數(shù)13 16 17 15細胞膜/fmol·mg-1·min-1 19.31±3.84 37.24±7.12a 21.62±5.23b 36.54±6.79a 37.27 0.000細胞質/fmol·mg-1·min-1 15.43±4.59 11.68±4.68a 16.50±2.80b 13.23±3.45b 4.90 0.004 PR陽性率（給藥后第12周）/%28.34±2.4 75.25±4.1a 32.25±2.8b 40.22±3.5b 656.10 0.000

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，子宮肌瘤是激素依賴性良性腫瘤，雌、孕激素在子宮肌瘤的生長中起協(xié)同作用，此外還與子宮平滑肌PKC活性密切相關［4-5］。相關研究表明［6-7］，子宮肌瘤內ER和PR的含量高于子宮正常肌組織，使用促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-α）治療后的子宮肌瘤中ER和PR的表達均明顯下降，說明肌瘤的生長與雌、孕激素受體有很重要聯(lián)系。Kawaguchi等［8］發(fā)現(xiàn)雌、孕激素均導致細胞有絲分裂率增加，與單用雌激素或無激素培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞的相比，在雌、孕激素培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞肌絲和致密體顯著增多，增生最活躍。Matsuo等［9］發(fā)現(xiàn)凋亡抑制基因產物Bcl-2蛋白和增生抗原Ki-67在肌瘤組織中明顯增多，表明孕激素是通過增強細胞內轉錄活化作用，實現(xiàn)提高有絲分裂率，達到抑制細胞凋亡的目的以促進肌瘤生長。本研究與相關文獻報道研究結果一致，模型組子宮肌瘤平滑肌組織的細胞核中PR陽性表達率顯著高于正常組。表明局部高PR濃度和高孕激素狀態(tài)可能是子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制。桂枝茯苓組與模型組相比，局部PR陽性表達率明顯下降，由于孕激素具有促進肌瘤生長并通過與PR結合發(fā)揮生物學效應來降低PR含量的作用，進一步證實了桂枝茯苓膠囊抗增生、抗肌瘤機制。

實體腫瘤微環(huán)境中缺氧是其基本特征之一，細胞在缺氧狀態(tài)下誘導血管生成、缺氧代謝等密切相關的基因表達是為適應缺氧環(huán)境［10-12］，缺氧刺激子宮平滑肌細胞可以引起其細胞膜和細胞質PKC活性的明顯改變。細胞質中的PKC活性下降，顯示缺氧可激活細胞質中的PKC信號傳導通路使細胞質中PKC活化。PKC是一種重要的信息傳導蛋白，介導生物信號從細胞膜向細胞核的傳遞，構成細胞內重要的信號轉導系統(tǒng)，對細胞分化、增殖和凋亡起重要調節(jié)作用［13-15］。本研究中細胞PKC是調節(jié)子宮平滑肌細胞收縮、受體結合、細胞增殖分化的信號傳遞通道的重要物質；主要以非活性形式存在于細胞質，當細胞質PKC激活時，會發(fā)生質膜轉位［16］，桂枝茯苓膠囊與米非司酮組比較更能顯著改善細胞PKC活性，促進平滑肌細胞PKC從病理性異常狀態(tài)恢復到接近正常水平，而且改善了子宮平滑肌細胞的缺氧狀態(tài)，切斷子宮平滑肌細胞增殖分化信號傳遞通道，從而達到抑制肌瘤的目的。

本研究提示桂枝茯苓膠囊顯著下調子宮肌瘤模型大鼠平滑肌細胞PR、PKC陽性表達，改善子宮平滑肌細胞的缺氧狀態(tài)，抑制血管生成，切斷子宮平滑肌細胞增殖分化信號傳遞通道，是桂枝茯苓膠囊縮瘤、消瘤臨床療效顯著的作用機制之一。