海參鑒別技術研究進展

胡冉冉，邢冉冉，張九凱，葛毅強，陳 穎,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3.中國農(nóng)村技術開發(fā)中心，北京 100045）

海參是一種高蛋白、低脂肪的名貴海產(chǎn)品，其營養(yǎng)價值高且味道鮮美，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、必需脂肪酸以及微量元素等50多種營養(yǎng)成分，同時含有多糖、皂苷、膠原蛋白等重要的生物活性物質(zhì)[1]，在抗癌[2]、抗腫瘤[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]及抗凝血[5]等方面可發(fā)揮顯著功效。目前全球已知的海參共有1 500多種，但具有較高經(jīng)濟和食用價值的海參約有60 種。全球捕撈的海參中有90%左右供給亞洲地區(qū)以滿足其市場需求，中國是海參的最大消費市場[6]。在貿(mào)易中海參多以干海參、水發(fā)海參和海參膠囊、海參口服液、海參罐頭等海參制品的形式流通，鮮活產(chǎn)品和凍品僅占小部分[7]。經(jīng)過干制、切片、制粉等處理過的海參及制品使得消費者、經(jīng)銷商和監(jiān)管部門難以從形態(tài)上鑒別其種類和品質(zhì)。加之市場上海參種類繁多，產(chǎn)地不同、營養(yǎng)成分及其含量各異等因素導致其價格相差可高達10 倍。一些不規(guī)范廠家為了謀取高額經(jīng)濟利益，在海參貿(mào)易中摻假造假時有發(fā)生，如以人造海參冒充真海參，通過貼假標簽用低值海參冒充高值海參干貨、產(chǎn)地造假冒充地理標志產(chǎn)品等[8]?！吨腥A人民共和國產(chǎn)品質(zhì)量法》第五十條規(guī)定產(chǎn)品不得摻雜、摻假，不得以假充真、以次充好，不得以不合格產(chǎn)品冒充合格產(chǎn)品。GB 7718—2011《食品安全國家標準 預包裝食品標簽通則》以及GB 13432—2013《食品安全國家標準 預包裝特殊膳食用食品標簽》也都規(guī)定了食品標簽的真實性，不允許利用食品標簽名稱混淆食品的真實屬性欺騙消費者。鑒于此，上述海參貿(mào)易中存在的經(jīng)濟利益驅(qū)動的食品摻假行為（economically motivated adulteration，EMA）不僅直接損害消費者的經(jīng)濟利益，而且侵犯了地理標志產(chǎn)品生產(chǎn)商的權益，干擾了海參市場秩序。因此加強海參物種和產(chǎn)地的鑒別對打擊海參摻假造假行為十分必要。

隨著生物技術的不斷發(fā)展，目前國內(nèi)外學者已經(jīng)利用形態(tài)學、光譜和質(zhì)譜以及分子生物學等技術從海參形態(tài)、所含的化學物質(zhì)、核酸差異等方面鑒別海參。本文對近年來常用的海參鑒別方法進行綜述，介紹各方法的特點和應用情況，以期為進一步建立海參鑒別技術提供科學依據(jù)。

1 食用海參的分類及分布

目前世界海參漁業(yè)中已知的60 種食用海參分屬于海參綱的3 個目、4 個科、14 個屬（表1）[9]。這些食用海參主要分布于70多個國家的部分極地地區(qū)、溫帶和整個熱帶海域地區(qū)[10]。其中，熱帶地區(qū)海參資源豐富、種類多、數(shù)量大，約占世界海參總產(chǎn)量的86%，多分布在太平洋和印度洋的熱帶區(qū)；溫帶海域海參資源呈單種性，集中分布在太平洋東西兩岸，主要以刺參科為主。在我國北方的溫寒帶海域僅有一種仿刺參可供食用，南方海域產(chǎn)有約20 種食用海參[11]。根據(jù)種類、外觀、顏色、體壁厚度、營養(yǎng)價值及市場趨勢、需求，一般將商品海參分為低值、中值或高值3 個等級。高值海參有仿刺參、黑乳海參、黃乳海參、糙海參等，中值海參有烏皺輻肛參、棘輻肛參、梅花參等，而玉足海參、綠刺參、花刺參等商業(yè)價值較低。

表1 食用海參的生物學分類Table 1 Biological classification of edible sea cucumber

2 海參鑒別技術

2.1 形態(tài)學鑒定

形態(tài)學鑒定主要是通過顯微鏡觀察海參骨片形狀、數(shù)量的差異實現(xiàn)對海參物種的分類和鑒定。骨片是位于海參真皮表層的內(nèi)骨骼。隨著海參幼體的成長，海參骨片形態(tài)和數(shù)量發(fā)生變化，直到海參成體后其骨片種類和形態(tài)非常穩(wěn)定。廖玉麟[12]詳細描述了我國134 種海參骨片的形態(tài)學特征，為后續(xù)我國海參骨片的形態(tài)學鑒定奠定了基礎。一項對我國西沙群島6 種熱帶海參背脊中部和腹部骨片超顯微結構的研究表明：同一屬的海參骨片種類有一定共性，而不同屬的海參骨片種類有所差異，根據(jù)骨片的細微結構可在種水平上鑒別這8 種海參[13]。在此研究中，使用放大倍數(shù)更高的掃描電子顯微鏡觀察，還在6 種海參中發(fā)現(xiàn)了新的海參骨片，豐富了海參骨片的形態(tài)學資料。Kamarudin等[14]利用掃描電子顯微鏡觀察海參的胃腸道和呼吸樹的骨片形狀，根據(jù)呼吸樹骨片中是否觀察到Y形棒狀骨片這一特征可區(qū)分馬來西亞的兩種海參Stichopus horrens和Holothuria leucospilota。隨后其又通過腹側(cè)角質(zhì)層的骨片形狀對Holothuria scabra、S.horrens和Stichopus ocellatus3 種海參進行了有效地區(qū)分[15]。但此研究在S.horrens和S.ocellatus中沒有觀察到之前報道過的骨片形狀，可能是由于這兩種海參受到環(huán)境的影響，形態(tài)發(fā)生了變化，導致骨片形狀隨之改變，這也說明海參生長環(huán)境對骨片形態(tài)學鑒定結果的準確性有一定的影響。文菁等[16]通過對新鮮仿刺參、市售干仿刺參和冷凍仿刺參產(chǎn)品的背脊部骨片觀察，發(fā)現(xiàn)鮮仿刺參和干仿刺參的骨片形態(tài)和結構基本相似，而與冷凍仿刺參的骨片存在明顯差異，初步判定冷凍仿刺參為假冒產(chǎn)品，將形態(tài)學鑒定結果結合DNA測序的鑒別結果，最終確定此冷凍仿刺參為假冒仿刺參。

上述研究均表明利用形態(tài)學鑒定方法可以實現(xiàn)對完整個體較為準確的鑒定。但當海參個體不完整或經(jīng)加工處理后用于鑒別的形態(tài)特征消失，形態(tài)學鑒定方法就受到了限制[17]。此外，海參的形態(tài)學鑒定方法僅限于有豐富鑒別經(jīng)驗的專業(yè)人員，因此應用形態(tài)學方法鑒定海參難以普及，不易標準化。

2.2 理化鑒定方法

隨著現(xiàn)代儀器分析技術的發(fā)展，理化鑒定方法操作越來越簡單，逐漸應用到了水產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別中。目前以光譜、色譜和質(zhì)譜為主結合化學計量學法的理化鑒定技術已經(jīng)應用于海參的種類鑒定和產(chǎn)地溯源中。特別是在鑒別不同地理區(qū)域分布的物種時，理化鑒定技術被認為是行之有效的方法。

2.2.1 光譜技術

2.2.1.1 紅外光譜

紅外光譜是根據(jù)紅外光譜圖中振動峰的位置、數(shù)目、形狀和強度，結合化學計量學方法建立數(shù)學模型，可以實現(xiàn)對樣品的定性和定量分析的技術。其中，中紅外（mid-infrared，MIR）區(qū)和近紅外（near infrared，NIR）區(qū)是紅外活性振動和旋轉(zhuǎn)吸收最強的區(qū)域，常應用于食品化合物的檢測[18]。NIR信號主要由復雜的倍頻峰和短波組合構成，而MIR信號來源于簡單的分子振動能級躍遷，因此MIR比NIR呈現(xiàn)出更清晰的光譜峰值，具有更強的鑒別能力。但NIR相比MIR儀器成本較低，受空氣濕度的影響小，且方便攜帶，更適合現(xiàn)場分析。

在1 700～600 cm-1的MIR區(qū)，Wu Zhongchen等[19]采用漫反射中紅外傅里葉變換光譜技術（diffuse reflectance infrared Fourier transform spectroscopy，DRIFTS）對來自榮成、威海、大連和煙臺4 個不同地理區(qū)域的96 個干刺參樣品進行鑒別，結合主成分分析法（principal component analysis，PCA）建立的二維散點圖以及簇類獨立軟模式識別（soft independent modeling of class analogy，SIMCA），成功區(qū)分出了4 個不同產(chǎn)地分布的干刺參。隨后，陶琳等[20]對同樣來自榮成、威海、大連和煙臺4 個產(chǎn)地的96 個干刺參樣品進行NIR光譜特征分析，主成分聚類建立的聚類三維圖顯示4 個產(chǎn)地的海參分別聚在4 個相對獨立的區(qū)域，由此可成功區(qū)分4 個產(chǎn)地的海參。上述研究表明MIR和NIR均可為打擊產(chǎn)地造假行為提供有效的技術手段。此外，NIR還應用于海參化學物質(zhì)的定量分析中，在海參品質(zhì)的快速檢測方面發(fā)揮作用。鄒小波等[21]利用NIR對大連、福建、連云港和山東4 個產(chǎn)地的43 個海參進行產(chǎn)地鑒別時，建立的三維PCA圖顯示4 個產(chǎn)地的海參樣品存在交叉，無法準確區(qū)分4 個產(chǎn)地的海參，進一步采用最小二乘支持向量機（least squares support vector machine，LSSVM）模型識別對4 個產(chǎn)地的海參校正集識別率達到100%，預測集識別率為97.67%。此研究基于NIR聯(lián)合區(qū)間向后區(qū)間偏最小二乘法（backwards interval partial least squares，Bi PLS）挑選特征波段建立海參NIR與膠原蛋白含量的偏最小二乘法（partial least squares，PLS）預測模型，還可實現(xiàn)對不同產(chǎn)地海參中膠原蛋白的定量檢測。

盡管利用紅外光譜鑒別時需要大量測量值已知的樣品建立數(shù)據(jù)分析模型，但紅外光譜技術不需要繁瑣的樣品制備，可對完整的食品樣本進行無損檢測，是一種快速、簡單、綠色的鑒定方法，在海參產(chǎn)地溯源中具有較好的應用前景。

2.2.1.2 核磁共振

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）根據(jù)原子核躍遷產(chǎn)生的共振圖譜特征達到對樣品鑒定的目的。常用的原子核有1H、13C、17O、31P和23Na等。其中，氫核磁共振（1H-NMR）只有1 個中子，具有很強的磁矩，因食品中各組分都含有氫元素，使得其在食品檢測中應用廣泛[22]。目前，NMR技術在海參鑒別中的研究較少，主要集中在利用圖譜信息解析海參多糖結構。海參體壁的多糖主要分為海參硫酸軟骨素（sea cucumber chondroitin sulfate，SC-CHS）和海參巖藻聚糖硫酸酯（sea cucumber fucoidan，SC-FUC）兩大類，不同種類的海參其多糖結構有一定的差異。陳士國等[23]從阿拉斯加刺參、日本刺參、墨西哥刺參、八刺參、北極海參、冰島刺參、明禿參、海地瓜8 種海參中的粗多糖中分離純化到SC-CHS，利用高溫1H-NMR技術比較了不同海參的SC-CHS結構，結果顯示8 種海參的SC-CHS異頭氫信號差異明顯，表明通過SC-CHS的圖譜差異可鑒別不同種類的海參。與此研究類似，Wu Nian等[24]利用傅里葉變換紅外光譜分析儀結合高溫1H-NMR技術對挪威海岸的Holothuria vagabunda、印度太平洋的Holothuria graeffei、西印度洋的Stichopus tremulu和大西洋的Isostichopus badionotu 4 種海參的粗多糖中分離純化的SC-FUC結構進行了鑒定，根據(jù)SC-FUC異頭氫信號差異初步建立了不同海域的海參指紋圖譜，對于海參的產(chǎn)地是否與SC-FUC的結構有一定關系還需要擴大不同海域的海參樣本數(shù)量進一步研究。

2.2.2 高效液相色譜

高效液相色譜（h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d chromatography，HPLC）技術以液體作為流動相，靠分離組分的分子與流動相爭奪吸附表面活性中心的能力差別而實現(xiàn)對混合物的快速分離，檢測過程中無需衍生化，被廣泛用于鑒別蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、酚類化合物等物質(zhì)[25]。

皂苷是HPLC在海參真實屬性鑒定中的主要檢測對象。海參皂苷的組成和含量受分類和生長環(huán)境的影響。通過確定皂苷寡糖鏈中單糖的結構、種類、比例，可對海參進行分類鑒定[26]。有研究采用HPLC技術采集了8 種市售海參的總皂苷特征圖譜，發(fā)現(xiàn)不同海參的皂苷組成和含量存在明顯差異。其中，海參科含有的皂苷種類較少，同一屬的海參皂苷組成有交叉；刺參科含有的皂苷組成復雜并有其獨特性，根據(jù)總皂苷色譜峰數(shù)目和保留時間的差異可有效區(qū)分這8 種海參[27]。在此研究基礎上，Yang Jie等[28]將HPLC和電噴霧電離質(zhì)譜法結合，建立了一種分離海參三萜皂苷的新型方法。根據(jù)三萜皂苷的含量和特殊結構可區(qū)分不同種類的海參，并將此方法成功應用于8 種市售海參的物種鑒定。雖然HPLC在海參種類鑒定方面發(fā)揮了很大的作用，但采用HPLC技術對皂苷結構進行分析的方法在海參產(chǎn)地鑒別方面卻未取得理想的效果。于林芳等[29]對皂苷作為指標鑒別海參產(chǎn)地的可行性進行了研究，采用HPLC建立了10 批不同產(chǎn)地的仿刺參的皂苷指紋圖譜，結果發(fā)現(xiàn)雖然個別產(chǎn)地的海參皂苷含量相對比值有所差異，但這種個體差異是正常的現(xiàn)象，不能據(jù)此鑒別出不同產(chǎn)地的仿刺參，對于HPLC技術利用皂苷鑒別不同產(chǎn)地的仿刺參還需要擴大樣本數(shù)量進一步研究。

利用HPLC技術對海參樣品的種屬特異性化學物質(zhì)進行檢測，可實現(xiàn)鮮海參、初級加工的干海參物種的鑒定。此方法具有較高的準確性、精密度和可重復性，但不適用于深加工海參產(chǎn)品的鑒別。這主要是因為海參加工制品中含有的其他配料不利于特定化學組分的分離純化和結構鑒定，而且化學物質(zhì)結構和組成在加工過程中可能會受到高溫、酸、堿等處理而發(fā)生變化，影響鑒定結果的準確性。

2.2.3 質(zhì)譜技術

2.2.3.1 穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜

穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜（isotope ratio mass spectrometry，IRMS）的工作原理是將樣品轉(zhuǎn)化為氣體，在離子源和電磁作用下離子得到分離，將離子束強度轉(zhuǎn)化為同位素豐度進而得到同位素比值（如13C/12C、2H/1H、15N/14N等）。IRMS具有操作簡單、準確性和靈敏度高等優(yōu)點，目前已經(jīng)初步應用于海參的產(chǎn)地溯源中。但此方法的鑒定結果容易受到實驗外界環(huán)境條件的影響，導致鑒定結果不穩(wěn)定[30]。王志銳[31]采用IRMS技術對不同采樣點的仿刺參腸道、體壁、疣足的δ13C和δ15N指紋特征進行了研究，根據(jù)海參腸道的δ13C和δ15N值的分布特征差異可鑒別出渤海灣和黃海灣的大部分海參，不同海域下的少數(shù)海參樣品的δ13C和δ15N值分布區(qū)域有重疊；同時，同一海域不同采樣點的海參也可根據(jù)海參腸道、體壁的δ13C和δ15N值的特異分布特征區(qū)分開。此研究還提出通過海參疣足δ15N值的差異區(qū)分海參的生長年限進而區(qū)分野生海參和養(yǎng)殖海參具有可行性。針對該研究δ13C和δ15N值分布區(qū)域重疊的海參樣品，需借助其他的方法進一步鑒別。最近，Zhang Xufeng等[32]也進行了類似的研究，利用IRMS技術分析中國北部海域7 個采樣點133 個仿刺參樣品的δ13C和δ15N值，將數(shù)據(jù)進行PCA分析和判別分析（discriminant analysis，DA），結果得到不同地理區(qū)域分布的仿刺參體壁δ13C和δ15N值，發(fā)現(xiàn)除了煙臺擔子島和大連長海島的δ13C和δ15N同位素組成有部分重疊，其他5 個采樣點的仿刺參δ13C和δ15N值都存在差異，但是大連瓦房店和皮口的海參同位素差異不明顯，可能是因為大連瓦房店和皮口地理位置較近或兩地的海參食物來源相近。因此僅利用IRMS技術對海參的δ13C和δ15N值的檢測不能完全實現(xiàn)對不同產(chǎn)地海參的鑒別。

2.2.3.2 電感耦合等離子質(zhì)譜

電感耦合等離子質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）技術是一種可以同時對多個無機微量元素進行檢測的技術，具有高靈敏度、超痕量檢測限以及快速分析等優(yōu)點[33]。水產(chǎn)品體內(nèi)的微量元素組成及含量會受其地理環(huán)境因素的影響，因此通過檢測海參體內(nèi)的微量元素差異可以鑒別不同產(chǎn)地的海參。Liu Xiaofang等[34]利用ICP-MS技術對我國渤海、黃海和東海3 個海域的39 個刺參體內(nèi)Al、Fe、Mn、Zn、Cu、V、Cr、Co、As、Ni、Se、Mo、Hg、Pb、Cd共15 種元素進行檢測，結合PCA、聚類分析（cluster analysis，CA）以及線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）3 種統(tǒng)計學方法，結果顯示3 種分析方法對刺參產(chǎn)地的識別交叉率為100%，大幅降低了誤判率，證實ICP-MS技術可應用于中國三大海域刺參的產(chǎn)地溯源。

此外，在利用ICP-MS技術應注意盡管海參體內(nèi)的微量元素受地域因素的影響常會有很大差異，但這種差異并不穩(wěn)定，受海參食物來源改變的影響，一些污染元素如Pb、Zn等，其含量在地域之間的差異也可能會隨著時間的推移而發(fā)生轉(zhuǎn)變。ICP-MS技術的另一個缺點是樣品的前處理與分析費時費力，且價格昂貴，尤其在分析揮發(fā)性元素時，對樣品處理的要求極高。

2.2.3.3 表面解吸常壓化學電離質(zhì)譜

近幾年新興的表面解吸常壓化學電離質(zhì)譜（desorption atmospheric pressure chemical ionizationmass spectrometry，DAPCI-MS）技術無需經(jīng)過樣品預處理，在常溫、常壓、無解吸溶劑的作用下，即可通過對樣品表面痕量物質(zhì)的解吸電離從而獲取樣品的指紋圖譜。此方法作為一種樣品無損檢測方法，在食品真?zhèn)舞b別中具有廣闊的應用前景[35]。目前，DAPCI-MS技術已經(jīng)初步應用于海參的產(chǎn)地溯源。Wu Zhongchen等[36]通過DAPCI-MS方法獲得我國威海、大連、煙臺產(chǎn)的162 個刺參的質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)m/z集中在50～800區(qū)域質(zhì)譜具有顯著強度的信號。結合PCA和SIMCA模型對指紋圖譜進行分析，發(fā)現(xiàn)根據(jù)海參指紋圖譜間的差異可成功區(qū)分3 個不同產(chǎn)地的刺參。此研究實驗數(shù)據(jù)還表明，雖然海參樣品表面粗糙度在一定程度上影響質(zhì)譜信號水平，但這并不會影響干海參產(chǎn)地鑒別的準確性，證明DAPCI-MS有望成為一種方便、實時、快速的產(chǎn)地鑒別分析技術。

2.2.3.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技術充分發(fā)揮了氣相色譜高效分離和質(zhì)譜定性能力強的特點，使鑒定結果更加準確。脂肪酸是GC-MS在海參鑒別中的主要研究對象，Zhang Xufeng等[32]利用GC-MS技術測定我國北部海域不同采樣點的仿刺參的脂肪酸成分含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的仿刺參樣品中脂肪酸含量均存在顯著差異；萊州的仿刺參單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸含量高，但多不飽和脂肪酸含量低；而產(chǎn)于獐子島的仿刺參樣品飽和脂肪酸含量最低，多不飽和脂肪酸含量高。通過脂肪酸成分含量差異結合PCA分析可以有效鑒定不同地理區(qū)域分布的仿刺參。在GC-MS基礎上，Liu Yu等[37]聯(lián)合使用GC-MS和IRMS建立了一種新型的特定化合物同位素分析法。將氣相色譜分離出的不同產(chǎn)地刺參的脂肪酸注入穩(wěn)定的同位素比值質(zhì)譜儀，研究脂肪酸的穩(wěn)定碳同位素組成，并結合多元統(tǒng)計分析和判別分析方法進行數(shù)據(jù)處理，結果表明除了長海島和獐子島，其他不同產(chǎn)地和不同季節(jié)的刺參根據(jù)脂肪酸的穩(wěn)定碳同位素顯著差異可有效區(qū)分開。此方法聯(lián)合使用氣相色譜和同位素質(zhì)譜結合統(tǒng)計學分析，避免了混合化合物中其他組分的影響，可為海參的產(chǎn)地溯源和鑒定提供理論依據(jù)，同時也可為其他水產(chǎn)品的穩(wěn)定同位素比值和脂肪酸成分的分析提供參考。這一研究也提示在食品真?zhèn)舞b別中，多種檢測方法聯(lián)合使用可以打破單種方法的局限性。

2.3 分子生物學鑒定

以DNA為基礎的分子生物學鑒定是近十年來發(fā)展最快的真?zhèn)舞b別技術。DNA穩(wěn)定性強，不受生物體生長發(fā)育階段、生理狀態(tài)等因素影響，具有特異性好、靈敏度高、準確性強等優(yōu)點。而且DNA分子耐熱性強，即使在深加工產(chǎn)品中，部分DNA分子發(fā)生降解斷裂，仍能提取出小片段的DNA。因此，基于DNA的分子生物學方法在食品鑒別中應用越來越廣泛。目前應用于海參鑒定的分子生物學技術主要包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、分子指紋圖譜技術、DNA條形碼技術等。

2.3.1 PCR技術

以DNA為基礎的PCR技術是食品鑒別常用的方法之一。最早發(fā)展起來的PCR技術是普通PCR，一個體系中只有一對特異性引物和單一模板。Wen Jing等[38]根據(jù)11 種海參設計出11 個種特異性PCR反向引物，結合通用正向引物16 Sar序列進行PCR擴增，得到269～406 bp的種特異性16S rRNA片段。此方法成功應用于市售海參樣品鑒定中，并檢測出2 種市售冷凍海參以次充好。隨后，2014年Wen Jing等[39]利用上述技術又設計了10 個種特異性PCR反向引物，成功鑒定出另外10 種海參物種。此方法操作簡單、特異性強，可用于單一成分的市售干海參鑒別中，但由于擴增目的片段長度差異較小，無法區(qū)分混合加工制品中的海參物種。在普通PCR的基礎上發(fā)展起來的多重PCR為混合海參物種的鑒定提供了新的工具。它是在一個PCR反應中加入多對特異性引物，同時擴增出多個具有明顯長度差異的目的片段的PCR技術。整個多重PCR過程中最關鍵的步驟就是引物的設計和反應體系、反應條件的優(yōu)化（如引物濃度、退火溫度等），這些關鍵點給多重PCR技術的實驗設計帶來了困難。Zuo Tao等[40]基于692 bp的線粒體細胞色素c氧化酶亞基I（cytochrome oxidase subunit I，COI）基因片段，針對仿刺參、北大西洋海參、梅花參和紅海參分別設計了4 對特異性引物，得到不同長度的擴增產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物的電泳條帶位置就可明顯區(qū)分這4 種海參。該方法的靈敏度達到納克級別，可以同時檢測出混合樣品中的這4 種海參物種。

實時熒光定量PCR技術（real-time quantitative PCR，qPCR）是PCR在海參物種鑒定中的另外一個應用。此技術是利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR過程，模板Ct值與每個模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值就越小。通過Ct值和拷貝數(shù)建立的標準曲線可對樣品進行定性和定量分析[41]。qPCR的常見方法主要包括染料法和探針法兩種。染料法是在PCR體系中加入熒光染料如SYBR Green I，PCR反應產(chǎn)物通過熔解曲線進一步分析，此方法適用性廣、成本較低，但每孔只能檢測一個目標基因；探針法體系中除了特異性的引物還需要特異性的探針才能釋放熒光信號，此方法可同時擴增多個目標基因，但合成探針價格較高，而且不同引物探針體系的選擇、驗證會產(chǎn)生龐大的工作量。目前TaqMan探針qPCR技術已經(jīng)用于仿刺參的鑒定。曹際娟等[42]基于仿刺參線粒體COI基因、NAD 4基因分別設計特異性引物和探針，所建立的qPCR方法的變異系數(shù)小于2%，重復性良好，可應用于仿刺參的快速鑒定。此外，該研究擴增的靶基因片段長度均小于150 bp，因此建立的方法也適用于經(jīng)過高壓或高溫等處理過的DNA容易降解的深加工海參制品的物種來源鑒定。隨著多重qPCR的發(fā)展，將qPCR和多重PCR結合，實現(xiàn)多成分的檢測也將是建立海參快速鑒別方法研究的方向之一。

2.3.2 分子指紋圖譜技術

2.3.2.1 限制性片段長度多態(tài)性

限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）利用通用引物擴增目標DNA片段，采用不同的限制性內(nèi)切酶將PCR產(chǎn)物進行酶切，根據(jù)酶切產(chǎn)物的凝膠電泳條帶鑒別不同基因型[43]。PCR-RFLP技術最關鍵的步驟是限制性內(nèi)切酶的選擇，要考慮不同地理分布個體的目標片段序列差異[44]。文菁等[8]采用3 種核酸內(nèi)切酶（Dde I、Hae III和Sty I）對16 種海參570 bp左右的16S rRNA基因片段進行酶切，分別產(chǎn)生10、5 種和5 種單倍型，通過單倍型的組合可有效區(qū)分16 種海參的種類；將此方法應用于19 種商品海參凍品及干品的鑒定中，發(fā)現(xiàn)9 種海參產(chǎn)品出現(xiàn)標簽錯誤的現(xiàn)象。PCR-RFLP技術應用于海參物種鑒定的另一個靶序列對象是COI基因，Lü Yingchun等[45]用限制性內(nèi)切酶BamH I、Kpn I、Pst I、Xba I 和Eco31 I對692 bp的COI基因片段進行酶切，根據(jù)酶切DNA圖譜結果成功鑒別出仿刺參、大西洋瓜參、梅花參、加州擬刺參和子安輻肛參這5 種海參。

雖然PCR-RFLP技術操作簡單、成本低，但此技術也存在一些缺點：此方法只適用于單一成分的樣品鑒定，混合成分的樣品會干擾實驗結果；種內(nèi)變異可能使目標序列某一特定的酶切位點消失或產(chǎn)生新的酶切位點，PCR產(chǎn)物酶切片段長度差異不大，可能造成結果假陰性[46]；此外，當PCR-RFLP技術應用于深加工食品鑒定時，由于深加工產(chǎn)品的DNA可能發(fā)生斷裂，只能提取到較短的DNA，選擇合適的限制性酶切位點較難。

2.3.2.2 隨機擴增多態(tài)性DNA

隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）的技術原理是將隨機多態(tài)核苷酸序列作為引物進行PCR擴增，通過電泳檢測擴增產(chǎn)物多態(tài)性來反映基因組DNA的多態(tài)性。目前PCR-RAPD技術已經(jīng)用于海參遺傳多樣性分析和產(chǎn)地溯源的研究中。Yun Zhenyu等[47]利用PCR-RAPD技術和基因片段測序技術評估遼寧大連、山東煙臺和威海這3 個產(chǎn)地的仿刺參的遺傳關系和DNA多態(tài)性。結果發(fā)現(xiàn)不同海域的海參各自具有獨特的基因特征，RAPD指紋圖譜CA結果顯示除了個別樣本外，大部分來自同一海域的樣本都聚集在同一分支中，大連仿刺參單獨聚為一個分支，煙臺和威海的仿刺參樣品地理位置相近，聚為一個分支。研究表明根據(jù)PCR-RAPD指紋圖譜可區(qū)分開這3 個產(chǎn)地的大部分仿刺參，個別不能區(qū)分的樣品還需要進一步鑒別。

對于基因組序列信息不了解的物種鑒定，PCR-RAPD技術可以作為一種簡便、快速的分子生物學鑒定方法。但該方法的主要缺點在于反應結果容易受反應體系各參數(shù)的影響，可重復性差[48]。當目標DNA的量少或發(fā)生降解時，物種特異性的長片段無法有效擴增或兩個不同物種的PCR產(chǎn)物長度類似，都會導致假陽性結果的產(chǎn)生[49]。

2.3.3 DNA條形碼技術

隨著DNA測序成本的降低，利用DNA序列鑒別物種的方法逐漸成熟。2003年，Herbert等[50]最早提出DNA條形碼的概念。DNA條形碼是利用一段或幾段標準的、較短的DNA序列作為標記實現(xiàn)物種鑒定的技術[51]。其技術核心是利用通用引物擴增目的基因片段，測序后通過數(shù)據(jù)庫比對確定物種信息。隨著全球物種基因條形碼的發(fā)展，結合已有的生命條形碼聯(lián)盟（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）數(shù)據(jù)庫和美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫，為食品的真?zhèn)舞b別提供了新的工具。

DNA條形碼技術應用于海參物種鑒定的靶基因主要包括線粒體的COI、16S rRNA以及18S rRNA[68]和12S rRNA[69]。表2總結了利用DNA條形碼技術進行海參物種鑒定的相關研究。由于CBOL和NCBI數(shù)據(jù)庫中部分海參的12S rRNA和18S rRNA基因序列缺乏，使12S rRNA和18S rRNA基因作為基因條形碼對海參的物種鑒定具有一定的局限，這也說明仍然需要大量的研究工作才能建立一個完善、可靠的海參DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。目前常用COI和16S rRNA基因序列作為海參的條形碼區(qū)域。李穎等[52]對11 個海參3 段線粒體基因（IrRNA-COI、16S rRNA和COI）片段進行擴增與測序，通過比較后發(fā)現(xiàn)COI基因保守性較好，其沒有插入或缺失位點，而且多態(tài)位點比例較低，適合作為海參分類的分子標記。隨后梁君妮等[53]也證實了利用COI基因片段可以有效鑒定海參物種，通過對海參線粒體COI基因進行測序可區(qū)分不同種類的海參，并將此方法成功地應用于海參營養(yǎng)液的物種鑒定中。Uthicke等[54]在分析商業(yè)海參物種的基因信息時，發(fā)現(xiàn)了96 種新的COI基因序列，使得利用基因信息鑒定商用海參的種類更加廣泛。最近，Amin等[55]對從印度尼西亞東爪哇收集到的一種海參進行物種鑒定，結合形態(tài)學鑒定和基于COI基因的DNA條形碼鑒定結果判定此物種為尻參科的海地瓜（Acaudina molpadioides）。此外，DNA條形碼技術已經(jīng)在市售海參產(chǎn)品標簽的調(diào)查研究中得到應用。Wen Jing等[57]采用DNA條形碼技術基于COI基因?qū)κ惺酆⒖茦悠返姆N類進行鑒定，發(fā)現(xiàn)有7 個海參種類鑒定結果與商業(yè)標簽名稱不一致，樣品標簽不符率為63.6%。隨后又基于16S rRNA序列對市售刺參科海參的種類進行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中一個商業(yè)標簽為刺參（仿刺參屬）的物種其DNA條形碼鑒定結果為暗刺參屬[58]。

表2 DNA條形碼技術在海參物種鑒定中的相關研究Table 2 Summary of previous esearch on species identification of sea cucumber by DNA barcoding

標準的DNA條形碼技術要求從樣品中能提出比較完整的DNA片段，一般長度在500～700 bp，可適用于新鮮或初級加工食品的鑒定中。但對于深加工產(chǎn)品例如罐頭等，加工過程中的高溫、高壓和輻射以及酸堿、添加劑的加入等均會使原料DNA片段發(fā)生不同程度的斷裂、降解或變性等，給標準DNA條形碼技術的應用帶來很大困難，這就需要采用DNA條形碼（小于300 bp）來提高檢測成功率[70-71]。隨著市場需求推出的海參深加工制品越來越多，針對深加工海參制品尋找條形碼用以區(qū)分海參物種是目前DNA條形碼在海參真?zhèn)舞b別應用研究中的方向之一。此外，DNA條形碼技術應用于海參物種鑒定依賴于測序儀，不利于現(xiàn)場檢測。最近，針對食品摻假結合納米技術和DNA條形碼技術開發(fā)的一種納米示蹤劑，簡化了標準DNA條形碼相關的分析步驟（即DNA提取、條碼擴增和物種鑒定），可方便攜帶，不依賴于專業(yè)實驗室的測序就可實現(xiàn)物種鑒別[72]，使DNA條形碼技術在海參真?zhèn)舞b別中有更廣闊的應用前景。

3 海參鑒別方法比較

上述用于海參鑒別的三大類方法各有其優(yōu)缺點。形態(tài)學鑒定操作簡單、費用低，適用于初步的海參物種鑒定，對于形態(tài)學特征消失的海參加工制品無法準確鑒定。理化鑒定技術結合化學計量學方法主要實現(xiàn)的是對海參產(chǎn)地的鑒別。在我國不同產(chǎn)地的仿刺參質(zhì)量和價格不同，產(chǎn)地造假時常發(fā)生，色譜、紅外光譜、質(zhì)譜等技術為海參產(chǎn)地溯源提供了技術手段。但是，理化鑒定技術在鑒別準確性、穩(wěn)定性等方面還有待提高。基于核酸分析的分子生物學檢測方法不受季節(jié)、加工方法、產(chǎn)品形態(tài)的影響，鑒別結果準確度較高，在海參的物種鑒定中更具有優(yōu)勢，對產(chǎn)地的鑒別有一定的局限性。但根據(jù)不同產(chǎn)地的物種遺傳多樣性與地理來源是否有相關性，也可以在一定程度上區(qū)分海參產(chǎn)地。表3對三大類方法的主要特點、應用和局限性進行比較分析。沒有哪一種技術在食品鑒別上是完美的，每一種技術均為解決食品摻假造假問題提供不同層次的技術支撐。根據(jù)適用條件以及鑒別目的需求選擇適合的方法才能達到最有效的鑒定。此外，食品鑒偽研究正逐漸由單一技術的應用轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄠€技術輔助應用的方向發(fā)展。因此，鑒別研究不能局限于單一方法，必須要構建一個完善的鑒別技術體系。

表3 海參不同鑒別技術的比較Table 3 Comparison of different techniques used for identification of sea cucumber

4 結 語

科學、高效的海參鑒別技術是建立和完善海參鑒偽技術標準體系的基礎。通過對上述多項海參鑒偽技術的深入思考發(fā)現(xiàn)，快速、簡便、高通量、精準化仍然是海參鑒別技術的發(fā)展趨勢。在今后海參產(chǎn)地鑒別研究中還需在一定程度上提高鑒別的準確度，增加樣本數(shù)量，進一步開展化學計量學統(tǒng)計方法的有效性研究，篩選出最適的化學計量學方法，進而建立不同產(chǎn)地、不同種類海參的判別模型和相應的數(shù)據(jù)庫。市場上海參深加工制品的不斷推出也給海參的分子生物學鑒定帶來了一定的挑戰(zhàn)。加工制品中可能是多物種混合成分，從高度加工制品中提取出的DNA微量或DNA片段發(fā)生斷裂，這些都會給物種鑒別帶來困難。因此尋找較短的靶序列可應用于深加工制品的鑒定，并能在混合樣本中定性檢測以及定量分析是DNA檢測技術的研究工作之一。新興的高通量二代測序技術可同時對大量多物種混合樣本分析，實現(xiàn)對降解、微量的或低質(zhì)量的DNA樣品進行檢測，對未知食品、復雜食品或者深加工食品來說有著非常重要的作用，已經(jīng)應用于食品物種鑒定領域[73]，為分析食品中的物種成分提供新的研究工具。另一種高通量技術DNA微陣列可同時識別多種物種，顯著提高了檢測通量和速度，也將是海參DNA檢測技術的發(fā)展方向之一。除此之外，快速的現(xiàn)場鑒別技術是目前食品檢測的需求。環(huán)介導等溫PCR、與熒光結合的DNA納米技術等檢測方法可以直接通過肉眼觀察結果，對建立海參現(xiàn)場鑒別方法具有一定的啟發(fā)。