堿性電解水對籽瓜種仁蛋白質(zhì)提取效果的影響

李志豪，周 彬，王 萍，余雄偉，付琴利，李述剛,*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.武漢旭東食品有限公司，湖北 武漢 430068）

籽瓜（Citrullus lanatus var. megalaspermus）為葫蘆科西瓜屬植物[1]，其種仁中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)36%～40%，且其必需氨基酸的比例相比于大豆更接近聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）推薦值。此外，籽瓜種仁蛋白酶解產(chǎn)物具有很高的抗氧化活性，以2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)陽離子自由基清除能力與螯合Fe2+的能力較為突出，是一種值得開發(fā)的蛋白資源[2]。

堿溶酸沉法是目前運用最廣泛的一種植物蛋白提取方法，但是在高堿性條件下蛋白質(zhì)分子容易水解，次價鍵和氫鍵容易斷裂，且在提取過程中會產(chǎn)生一些非蛋白質(zhì)的副產(chǎn)物，影響了其推廣應(yīng)用[3]。電解水也稱為離子水，可通過在純水溶液兩端添加電極的方式獲得[4]。當(dāng)水溶液中添加外部電場時，帶電物質(zhì)往相反電荷的電極移動，會產(chǎn)生大量的H+和OH-，加上電解時間和電解質(zhì)的不同，溶液的pH值隨之發(fā)生改變。

電解水一般分為強電解水（主要包括強酸性電解水和強堿性電解水）和弱電解水（主要包括微酸性電解水和弱堿性電解水）。堿性電解水具有較高的負(fù)電位和還原能力，可以清除體內(nèi)多余的自由基，所以對多種老年?。ㄐ哪X血管疾病、腫瘤、糖尿病等）具有一定的輔助抗病功效[5]。因為堿性電解水具有容易進(jìn)入細(xì)胞間隙、滲透能力強和對環(huán)境無污染等特點[6-7]，Kobayashi等利用pH 3的強酸性電解水來提取桑葉中的有效成分1-脫氧野尻霉素，其提取率比用自來水提取提高了3%[8]。Tamaki[9]、Watanabe[10]等通過改變電解過程中的電解質(zhì)來調(diào)節(jié)溶劑pH值，在不添加酸或堿的情況下，不僅提高了米糠蛋白質(zhì)的提取率，而且促進(jìn)了海水的淡化。Toge等利用堿性電解水有效的提高了海水魚油的提取率[11]。Nabok等利用電解水提取葵花籽蛋白質(zhì)，與傳統(tǒng)的堿溶酸沉法相比，蛋白質(zhì)的提取率提高了10.4%[12]。

綜上所述，為了獲得一種新型的籽瓜種仁蛋白質(zhì)提取方法，本實驗以籽瓜種仁蛋白質(zhì)為研究對象，對比分析電解水與超純水對籽瓜種仁蛋白質(zhì)的提取率、結(jié)構(gòu)和功能特性方面的影響。分析探討堿性電解水提取方法對籽瓜種仁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能影響的內(nèi)在機制，旨在為植物堅果蛋白質(zhì)的高效綠色提取制備提供技術(shù)支撐，以促進(jìn)籽瓜種仁等植物堅果蛋白質(zhì)資源的開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

籽瓜種仁由新疆建設(shè)兵團(tuán)第一師九團(tuán)十連園藝場提供。

電解水（pH 8） 深圳市潤正電解技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白 美國Sigma公司；8 000～14 000 Da透析袋美國Biosharp公司；其他試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicoletis50傅里葉變換紅外光譜儀、Micro 21R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；YB-FD-1冷凍干燥機 上海億倍實業(yè)有限公司；J-1500圓二色光譜儀日本JASCO公司；SU-8010掃描電子顯微鏡、L-8900氨基酸分析儀、F4600熒光分光光度計 日本日立公司；DYY-8C電泳儀 北京六一公司；NanoZS納米粒度分析儀 英國Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 籽瓜種仁基本成分的測定

蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中微量凱氏定氮法。脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》?；曳仲|(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》。水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》。還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測定》。

1.3.2 樣品的制備與提取率的計算

籽瓜種子去殼、磨粉，稱取5 g用石油醚（30～60 ℃）按料液比1∶30脫脂，抽濾、揮發(fā)石油醚（重復(fù)脫脂一次），得到脫脂籽瓜種仁粉，對石油醚進(jìn)行回收。精確稱取等質(zhì)量脫脂粉末并分別加入電解水（pH 8）和超純水，按料液比1∶30混勻，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值分別為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，在35 ℃水浴鍋中磁力攪拌提取3 h，提取液采用冷凍離心機5 000 r/min離心15 min，取上清液，用相同提取液洗滌殘渣并離心15 min，重復(fù)兩次。合并上清液，用1.0 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，離心15 min，取沉淀溶解于100 mL超純水中，調(diào)節(jié)pH值至7.0，裝入截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da的透析袋中透析72 h。經(jīng)冷凍干燥獲分別得電解水提取的籽瓜種仁蛋白質(zhì)（electrolyzed water extracted seed kernel protein，EWP）和超純水提取的籽瓜種仁蛋白質(zhì)（ultrapure water extracted seed kernel protein，UWP），將樣品置于冰箱4 ℃冷藏備用。

用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液蛋白質(zhì)量濃度。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程：Y＝0.448 6X+0.019 9（R2＝0.998 4）。式中：X代表蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL），Y代表吸光度。

籽瓜種仁分離蛋白提取率按下式計算。

1.3.3 提取方法對籽瓜種仁蛋白質(zhì)成分的影響

氨基酸組成參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》中方法測定。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳參考Wu Wei等[13]的方法，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。

1.3.4 提取方法對籽瓜種仁蛋白理化特性的影響

粒徑采用納米粒度分布儀測定。表面疏水性參照Kato等[14]的方法測定。游離巰基和二硫鍵含量參照Beveridge等[15]的方法測定。

1.3.5 不同提取方法對籽瓜種仁蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響

1.3.5.1 傅里葉變換紅外光譜分析

采用KBr壓片法，掃描范圍為400～4 000 cm-1，對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行背景與基線校正。

1.3.5.2 圓二色光譜分析

在波長范圍190～250 nm、分辨率0.1 nm、響應(yīng)時間1 s條件下進(jìn)行3 次掃描，取平均值。

1.3.5.3 掃描電子顯微鏡觀察

使用掃描電子顯微鏡觀察顯微照片。將樣品涂抹在雙面導(dǎo)電黏合劑上，噴金。在15.0 kV的二次電子模式下進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.6 提取方法對籽瓜種仁蛋白功能特性的影響

參照Bera等[16]的方法測定籽瓜種仁蛋白的溶解性。乳化性和乳液穩(wěn)定性參照Pearce等[17]的方法測定。根據(jù)Bandyopadhyay等[18]的方法測定起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 籽瓜種仁常規(guī)營養(yǎng)成分分析

籽瓜種仁營養(yǎng)成分豐富，其中粗蛋白高達(dá)（36.87±0.97）%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、粗脂肪（45.96±1.13）%、還原糖（8.56±0.31）%、水分（4.93±0.12）%、灰分（3.42±0.05）%，說明其是一種重要的植物蛋白質(zhì)和油料資源。

2.2 提取方法對籽瓜種仁蛋白提取率的影響

圖1 提取方法對籽瓜種仁蛋白提取率的影響Fig. 1 Effect of extraction methods on the extraction rate of EWP and UWP

如圖1所示，隨著pH值的升高，籽瓜種仁蛋白質(zhì)的提取率也隨之增大，且電解水對籽瓜種仁蛋白的提取率顯著高于超純水，并在pH 10.0時達(dá)到最高，為90.07%。這可能是由于電解水中含有較多OH-，有利于H+脫離碳原子或硫酸鹽基團(tuán)和氫鍵的斷裂，使蛋白質(zhì)表面電荷數(shù)增加，促進(jìn)了蛋白質(zhì)間的靜電排斥和水合作用，使其更易溶解。

在較高的pH值條件下，籽瓜種仁中的多酚易氧化為醌類物質(zhì)，而醌類易與蛋白質(zhì)的游離巰基和氨基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)[19]，從而發(fā)生明顯的褐變現(xiàn)象，即在pH＞10時提取液褐變顯著[20]。因此，為了避免出現(xiàn)嚴(yán)重褐變反應(yīng)，本實驗選取的提取液最適pH值為9.5。

2.3 提取方法對籽瓜種仁蛋白質(zhì)成分的影響

圖2 EWP和UWP的凝膠電泳分析Fig. 2 Gel electrophoresis of EWP and UWP

由圖2可知，籽瓜種仁蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布集中在20～21、40～41、46～47 kDa之間，EWP與UWP在分子質(zhì)量上無明顯差異。

表1 籽瓜種仁蛋白氨基酸組成分析Table 1 Amino acid composition analysis of EWP and UWP

由表1可知，EWP的純度較高，且半胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸含量顯著大于UWP（P＜0.01，P＜0.05），天冬氨酸、谷氨酸含量極顯著小于UWP；其中纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸為人體必需氨基酸，且纈氨酸、異亮氨酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過FAO標(biāo)準(zhǔn)。另外，EWP中的半胱氨酸含量顯著高于UWP，可能是因為半胱氨酸是對氧化修飾最敏感的氨基酸之一，且二硫鍵是在蛋白質(zhì)多肽鏈半胱氨酸之間形成的[21]。

2.4 提取方法對籽瓜種仁蛋白理化特性的影響

二硫鍵是蛋白質(zhì)多肽鏈的兩個半胱氨酸之間形成的共價鍵，是衡量蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及其功能的重要指標(biāo)。在圖3A中，EWP的游離巰基含量（14.85 μmol/g）顯著高于UWP（13.92 μmol/g），二硫鍵含量（3.82 μmol/g）略低于UWP（4.26 μmol/g）。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因為電解水中的電解質(zhì)使二硫鍵斷裂，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變小，溶解性增加[22-23]。EWP中的二硫鍵含量高于UWP，也證明了EWP中的半胱氨酸含量高于UWP。

圖3 提取方法對籽瓜種仁蛋白理化特性的影響Fig. 3 Effect of extraction methods on physicochemical properties of EWP and UWP

蛋白質(zhì)的表面疏水性在評價蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)和構(gòu)象變化的過程中起著至關(guān)重要的作用，可以反映蛋白質(zhì)分子間相互作用的能力，是反映蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸含量的一個重要指標(biāo)，與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)密切相關(guān)[14]。如圖3B所示，EWP的表面疏水性高于UWP，這是因為提取過程中電解水中的離子強度較高，通過靜電屏蔽效應(yīng)降低了膠體顆粒的表面電勢，從而增加了非極性基團(tuán)間的疏水作用[24]。有研究報道在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)疏水性越大，暴露出來的疏水性殘基越多，與味蕾接觸產(chǎn)生的苦味越明顯，對食品的感官品質(zhì)造成了不良影響[25]。

激光納米粒度測定儀可對樣品的可溶性部分進(jìn)行測定，其結(jié)果一定程度上可以反映籽瓜種仁蛋白質(zhì)的聚集程度。如圖3C所示，EWP中的粒徑分布在105.7～122.4 nm范圍內(nèi)，UWP中的粒徑分布在295.3～396.1 nm范圍內(nèi)。這可能是由于在使用超純水提取過程中添加的堿溶液使籽瓜種仁蛋白質(zhì)的肽鏈降解，分子結(jié)構(gòu)展開，所以暴露的疏水基團(tuán)之間的相互作用強，且UWP的疏水性高于EWP，所以UWP中更加容易生成可溶性的聚集體，導(dǎo)致其平均粒徑變大。

2.5 提取方法對籽瓜種仁蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響

圖4 提取方法對籽瓜種仁蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響Fig. 4 Effect of extraction methods on the Fourier transform infrared spectroscopy and circular dichroism spectra structure of EWP and UWP

傅里葉變換紅外光譜和圓二色光譜是廣泛運用于食品蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中的技術(shù)，其可準(zhǔn)確地分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)所占的比例[26-27]。由圖4A可知，酰胺I帶1 600～1 700 cm-1出現(xiàn)強吸收峰，利用PeakFit軟件的高斯曲線擬合峰面積計算得到籽瓜種仁蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)如表2所示，EWP中α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例相比于UWP明顯提高，β-折疊結(jié)構(gòu)比例有所下降。在圖4B中也可以看出類似的現(xiàn)象，EWP中α-螺旋所占比例大于UWP，因為α-螺旋與β-折疊結(jié)構(gòu)較為有序，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)較為無序，所以在EWP中的有序結(jié)構(gòu)比例之和大于UWP。α-螺旋結(jié)構(gòu)比例的降低可能是因為堿性電解水使籽瓜種仁蛋白質(zhì)從致密有序的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮o序的結(jié)構(gòu)，從而使得蛋白質(zhì)分子在一定程度上拉伸，這與沈瓊等的研究結(jié)果[28]基本一致。

表2 提取方法對籽瓜種仁蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響Table 2 Effect of extraction methods onthe secondary structure of EWP and UWP

2.6 提取方法對籽瓜種仁蛋白功能特性的影響

評價一種蛋白質(zhì)功能特性優(yōu)劣的指標(biāo)通常有蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性和起泡性等。蛋白質(zhì)溶解性在很大程度上可表征蛋白質(zhì)的水合作用能力，也可以用來簡單地表征籽瓜種仁蛋白質(zhì)的聚集和變性程度。由圖5A可知，EWP的溶解性為13.14 mg/mL，UWP的溶解性為9.42 mg/mL。這可能是因為在EWP提取過程中添加了大量的電解質(zhì)，使蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)延伸，蛋白分子展開，結(jié)構(gòu)變得松散，從而提高了其溶解性[29]。

蛋白質(zhì)的乳化效果主要依靠降低油-水界面的張力來控制吸附層油滴的擴(kuò)散和聚集。如圖5B所示，在乳化性方面，EWP（937.58 m2/g）顯著高于UWP（753.34 m2/g），然而其乳化穩(wěn)定性（29.63 min）卻略低于UWP（32.16 min）。這可能是因為在提取過程中，由于電解水中電解質(zhì)的作用使籽瓜種仁蛋白質(zhì)多肽鏈斷裂，使其易于擴(kuò)散，進(jìn)而提高了其溶解性，增強了蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間的相互作用[18]。

圖5 提取方法對籽瓜種仁蛋白功能特性的影響Fig. 5 Effect of extraction methods on functional characteristics of EWP and UWP

蛋白質(zhì)起泡特性包括起泡性和泡沫穩(wěn)定性，前者指在一定條件下產(chǎn)生泡沫的量，后者則是所形成泡沫的穩(wěn)定性。如圖5C所示，EWP的起泡性為26.00%，泡沫穩(wěn)定性為45.45%；UWP的起泡性為23.10%，泡沫穩(wěn)定性為64.17%。這可能是因為EWP表面疏水性較大，游離巰基含量較高，使其在泡沫膜吸附層中分子間產(chǎn)生疏水相互作用的機會增大，增加了蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸殘基的暴露，從而提高了其起泡能力[30-31]。

2.7 提取方法對籽瓜種仁蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

掃描電子顯微鏡通常用于二次電子信號成像觀察樣品表面形態(tài)。由圖6A、B可知，在1 000 倍掃描電子顯微鏡下，EWP結(jié)構(gòu)均一、狀態(tài)較為分散；而UWP則聚集成團(tuán)、分散不均勻。通過4 000 倍掃描電子顯微鏡下的圖6C、D可更為清晰地觀察到這一現(xiàn)象：EWP粉末上附著著大小較為均一的細(xì)小顆粒，而UWP顆粒較大且大小不等、形態(tài)各異。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果進(jìn)一步說明了堿性電解水對籽瓜種仁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的影響。

圖6 EWP和UWP的掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 Scanning electron microscope images of EWP and UWP

3 結(jié) 論

本研究利用電解水提取籽瓜種仁蛋白質(zhì)，通過對比EWP和UWP的提取率、功能特性、理化特性、結(jié)構(gòu)特性，結(jié)果表明：在pH 8.5～10.0條件下，電解水提取籽瓜種仁蛋白質(zhì)的提取率比超純水高0.4%～3.1%，且EWP中的必需氨基酸含量較高，溶解性、乳化性、起泡性等較好；EWP的游離巰基含量顯著高于UWP，二硫鍵含量略低于UWP，表面疏水性較高，粒徑分布范圍較小，α-螺旋和β-折疊等有序結(jié)構(gòu)較多；掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示EWP結(jié)構(gòu)較為有序，外觀形態(tài)分散均一。此外，在制備堿性電解水的過程中無污染，對資源環(huán)境友好。因此，在今后的蛋白質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)中可直接利用電解調(diào)節(jié)提取溶劑pH值的方法降低堿液的用量，從而減小對環(huán)境的污染。