刺老苞根皮水煎劑對(duì)去勢(shì)小鼠的血清雌二醇、骨堿性磷酸酶及骨鈣素的影響及意義

王松月 薛帆 宋晶珠 李金誠(chéng) 裴凌鵬

100081民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京

刺老苞又名楤木，為五加科，屬頭序楤木、棘莖楤木、短序楤木，以及食用楤木，為土家族用來(lái)祛風(fēng)除濕，強(qiáng)筋健骨的常用藥[1]。刺老苞始載于《千金方》，治療腸癰，其他古代醫(yī)書(shū)對(duì)其也有相關(guān)記載，《本草推陳》中記載：“楤木樹(shù)皮及根皮均有健胃、收斂、利尿及降糖作用?！薄兜崮媳静荨分杏涊d：“刺腦包，又名刺老包、鵲不踏。味苦辛、性涼，入脾、腎二經(jīng)。治風(fēng)濕痛、胃痛、跌打損傷?！北緦?shí)驗(yàn)室前期的藥理作用研究表明，刺老包根皮可以改善大鼠骨質(zhì)量，減少骨髓腔的脂肪含量，抑制大鼠骨丟失。本研究的目的是通過(guò)去勢(shì)后小鼠模型，評(píng)估刺老苞根皮對(duì)于去勢(shì)后小鼠骨代謝血清學(xué)的影響及其意義。

資料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取健康SPF 級(jí)12 周齡C57雌性小鼠80只，體重(21.62±0.76)g，購(gòu)買(mǎi)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)[SCXK(京)2014-0010]。實(shí)驗(yàn)前，所有小鼠均于北京海淀區(qū)衛(wèi)計(jì)委實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心內(nèi)飼養(yǎng)，室溫維持于16～22 ℃，濕度60%～75%，明暗交替照射12 h/12 h，不限制水及食物的攝入，應(yīng)用常規(guī)鼠糧進(jìn)行喂養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)分組：第15 周去勢(shì)手術(shù)完成后，選取符合選入標(biāo)準(zhǔn)(陰道涂片無(wú)明顯動(dòng)情周期)小鼠，按照體重隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組(OVX，n=10)、空白對(duì)照組(Control group，CG，n=10)、刺老苞根皮水提取物組(CLB，n=10)、仙靈骨葆組(XL，n=10)、阿侖膦酸鈉組(AST，n=10)。

實(shí)驗(yàn)藥物：①刺老苞根皮水煎劑的制備：將干燥的刺老苞根皮生藥243.36 g加入10 倍蒸餾水于圓底燒瓶中，沸騰之后，于120 ℃加熱60 min，待冷卻后倒出水煎劑，再加入6 倍蒸餾水，沸騰后，于120 ℃加熱30 min，冷卻后合并兩次煎液，在常壓下進(jìn)行濃縮，濃縮至每100 mL 水煎劑含生藥79.7 g。②阿侖膦酸鈉：化學(xué)名1,1-二甲基-2-甲硫基乙胺，生產(chǎn)于杭州默沙東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130085。③仙靈骨葆膠囊：主要成分為淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃；生產(chǎn)于國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025337。

實(shí)驗(yàn)主要試劑：0.3%戊巴比妥鈉(10 mL/kg，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)研究院饋贈(zèng))、10 萬(wàn)U 青霉素注射液(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、75%酒精(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、0.9%氯化鈉溶液(天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠)、4%多聚甲醛(武漢賽維爾生物科技有限公司)、雌二醇試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)、骨堿性磷酸酶試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法，武漢華美生物工程有限公司)、骨鈣素檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)。

實(shí)驗(yàn)主要儀器：手術(shù)剪(蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司)、手術(shù)彎鉤鑷(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)、手術(shù)縫合針(上海小昱醫(yī)療器械有限公司)、手術(shù)縫合線(揚(yáng)州金環(huán)醫(yī)療器械廠)、倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、酶標(biāo)儀(FlexStation3，美國(guó)分子儀器公司)、-20℃冰箱(海信公司)、全自動(dòng)生化儀(日立7020)、載玻片(江蘇世泰器材有限公司)、電子天平(YP601N，上海菁海儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠)、離心機(jī)(D1008，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、 水浴鍋(TL-420D，姜堰市天力醫(yī)藥器械廠有限公司)、10 μL移液器(KE0012951，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

實(shí)驗(yàn)方法：①去勢(shì)骨質(zhì)疏松小鼠模型的制作：空白對(duì)照組僅從兩側(cè)卵巢旁邊切除少許脂肪組織，不做卵巢摘除，其他4 組均進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。首先用0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，待小鼠無(wú)自主神經(jīng)反射時(shí)，將小鼠進(jìn)行固定，手術(shù)時(shí)于腹部剃毛，形成約3 cm×5 cm 的去毛區(qū)，以75%酒精消毒后。其后于肋下1 cm 沿腹中線向下做縱向切口，長(zhǎng)約1～2 cm，切開(kāi)皮膚、筋膜后，鈍性分離肌肉，在腸系膜脂肪中找到呈粉紅色的卵巢及緊密相連的子宮角，結(jié)扎并切斷子宮角，將卵巢摘除，縫合腹部肌肉及皮膚。常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)后1 周給予10 萬(wàn)U 青霉素腹腔注射治療，與此同時(shí)采集小鼠陰道涂片，并于顯微鏡下觀察小鼠動(dòng)情周期是否完整，若未見(jiàn)完整動(dòng)情周期出現(xiàn)，即將小鼠納入下一步實(shí)驗(yàn)。②小鼠的給藥方法：去勢(shì)小鼠刺老苞根皮水煎劑組每天灌服刺老苞根皮水煎劑1.23 g/(kg·d)，去勢(shì)小鼠仙靈骨葆組每天灌服仙靈骨葆混懸液0.18 g/(kg·d)，去勢(shì)小鼠阿侖膦酸鈉組每天灌服阿侖膦酸鈉溶液1.22 mg/(kg·d)，去勢(shì)小鼠模型組及假手術(shù)空白對(duì)照組每天灌服等體積蒸餾水，共給藥12 周，給藥量隨小鼠每周體重變化而從新計(jì)算得出。③小鼠標(biāo)本采集及測(cè)定方法：經(jīng)灌胃12 周后，進(jìn)行取血處理，通過(guò)摘眼球取血法，將取出的全血于室溫下靜置2 h，離心，分離出血清，保存在-20 ℃的冰箱中。④血清堿性磷酸酶(ALP)含量測(cè)定方法：血清骨鈣素應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試法測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。⑤血清骨鈣素(DC)含量測(cè)定方法：血清骨鈣素應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試法測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。⑥血清雌二醇(E2)含量測(cè)定方法：血清骨鈣素應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試法測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

表1 刺老苞根皮水煎劑對(duì)血清E2、BALP和BGP水平的影響±s)

表1 刺老苞根皮水煎劑對(duì)血清E2、BALP和BGP水平的影響±s)

注：與去勢(shì)組相比，?P＜0.05；與空白對(duì)照組相比，??P＜0.05。

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結(jié) 果

血清E2水平：與去勢(shì)模型組相比，空白對(duì)照組E2含量(137.15±80.53)pg/mL,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)pg/mL；仙靈骨葆組E2含量(122.38±52.21)pg/mL，相較于空白對(duì)照組及模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；刺老苞根皮水煎劑組E2含量(97.84±11.58)pg/mL，相較于空白對(duì)照組及模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；阿侖膦酸鈉組E2含量(137.15±80.53)pg/mL，相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

血清骨堿性磷酸酶(BALP)水平：與去勢(shì)模型組相比，空白對(duì)照組BALP 含量(4 155.87±397.16)ng/mL 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；阿侖膦酸鈉組BALP 含量(3 904.86±300.21)ng/mL，相較于空白對(duì)照組及模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；仙靈骨葆組BALP 含量(3 793.77±533.24)ng/mL，相較于模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；刺老苞根皮水煎劑組BALP 含量(3 511.14±978.46)ng/mL，相較于模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

血清骨鈣素(BGP)水平：空白對(duì)照組BGP 含量(3.45±0.36)ng/mL，阿侖膦酸鈉BGP 含量(3.43±0.32)ng/mL，仙靈骨葆BGP 含量(3.44±0.28)ng/mL，刺老苞BGP含量(3.21±0.35)ng/mL，與去勢(shì)模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

討 論

本實(shí)驗(yàn)選取了阿侖膦酸鈉及仙靈骨葆作為小鼠的陽(yáng)性藥對(duì)照組，阿侖膦酸鈉作為雙膦酸鹽類(lèi)藥物對(duì)于骨質(zhì)疏松的預(yù)防有準(zhǔn)確的療效，可以有效減少骨吸收抑制骨破壞[2]。而仙靈骨葆在中醫(yī)學(xué)理論的指導(dǎo)下，主要以補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的理論來(lái)調(diào)節(jié)骨代謝，增高骨密度[3]，這與刺老苞根皮的功效有著相似之處，刺老苞根皮也具有強(qiáng)筋健骨的功效[4]，故選用這兩種藥來(lái)驗(yàn)證刺老苞根皮對(duì)于骨代謝的影響。

E2作為雌激素的存在形式，其含量可以反映雌激素的水平，去卵巢后雌激素的分泌明顯下降，雌激素具有促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡的作用，雌激素一旦降低則會(huì)引起骨代謝平衡失調(diào)，從而引發(fā)骨量流失，產(chǎn)生骨質(zhì)疏松[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組的E2含量明顯高于去勢(shì)力組的E2含量，說(shuō)明去勢(shì)小鼠模型的去勢(shì)手術(shù)是成功的，并且可能出現(xiàn)骨形成減少以及骨吸收增加的現(xiàn)象。

BALP 是骨形成的特異性指標(biāo)，并且可以反映出骨重建的活躍性。臨床的研究中也表明，BALP 可以作為骨代謝疾病的重要依據(jù)[6]。本實(shí)驗(yàn)中去勢(shì)組的BALP含量明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，并且也明顯高于仙靈骨葆組及刺老苞根皮水煎劑組(P＜0.05)，說(shuō)明了去勢(shì)組小鼠體內(nèi)可能存在部分成骨細(xì)胞破壞的現(xiàn)象，而刺老苞根皮水煎劑組，仙靈骨葆組對(duì)于去勢(shì)組小鼠有顯著的治療作用。血清中BGP 的變化，不僅反映了成骨細(xì)胞的活性，還是骨質(zhì)礦化的特殊標(biāo)志物[7]，本實(shí)驗(yàn)中各組小鼠的BGP 水平與模型組相比，均未有顯著性差異，說(shuō)明各組小鼠骨礦化速率無(wú)明顯差異。

綜上而言，刺老苞根皮水煎劑能夠有效降低去勢(shì)小鼠BALP 含量，但對(duì)于E2和BGP 水平影響不大，說(shuō)明刺老苞根皮水煎劑可能通過(guò)增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性改善去勢(shì)小鼠體內(nèi)骨代謝失衡的狀態(tài)，對(duì)于小鼠的骨形態(tài)的影響有待本實(shí)驗(yàn)室的后續(xù)檢測(cè)。