生防細菌對松材線蟲滅殺效果初步研究

王義勛 徐小文 祁高富 侯珊珊 許秀環(huán)蔡明乾 朱紅軍 陳京元

(1.湖北省林業(yè)科學研究院 武漢 430075； 2. 華中農(nóng)業(yè)大學 武漢 430070； 3. 武漢市林業(yè)科技推廣站 武漢 430024； 4.?？悼h林業(yè)局 十堰 441600)

松材線蟲病(又稱松樹萎蔫病)是松樹上的一種極具毀滅性的病害，是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的我國目前危害最嚴重的檢疫性病害之一[1]。敏感型松樹感染松材線蟲后，最快的40多天即可枯死[2]。松材線蟲的寄主高達數(shù)十種，其蔓延迅速，發(fā)生面積不斷擴大，危害程度不斷加重，對我國的松樹資源、自然景觀和生態(tài)環(huán)境構成了嚴重威脅[3]。近年來，在湖北省境內(nèi)，松材線蟲病大面積發(fā)生，疫情日趨嚴重，對我省的松樹資源造成了巨大的威脅。在這種形勢下，找到新型高效的防控措施成為迫切的需要。松材線蟲的防治對于控制松材線蟲病起著至關重要的作用，隨著該病害的日益蔓延，利用高效、低毒、選擇性好的生物防治方法來防控松材線蟲病成為研究的熱門。在前期的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)了10株對根結(jié)線蟲具有良好防治效果的生防菌，本研究以這10株生防菌為實驗材料，展開了室內(nèi)和林間的殺蟲活性實驗測定，為松材線蟲病生物防治試劑的選擇擴增了范圍，也為尋找潛在的有效生防菌株提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為本實驗室保存的10株對根結(jié)線蟲有較好防治效果的生防菌株(菌株編號分別為A4、A12、A15、A16、A18、B3、B9、B12、D1、D4)。松材線蟲和灰葡萄孢菌均由南京林業(yè)大學提供。松材線蟲的保存方法參見文獻[4]。

1.2 培養(yǎng)基和抗生素

1.8 % 水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂18 g ，去離子水定容至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌后使用。

M9緩沖液：Na2HPO4·7H2O 5.8 g，KH2PO43.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水定容至1 L，高壓蒸汽滅菌后加入終濃度為0.1 mg/mL MgSO4·7H2O使用。

鏈霉素：溶解0.1 g鏈霉素于足量的蒸餾水中，最后定容至10 mL。以100 mg/mL的終濃度添加于細胞培養(yǎng)板中，用于抑制雜菌的生長。

氯霉素：溶解0.02 g膽固醇于足量的無水乙醇中，蒸餾水定容至10 mL。以2 mg/mL的終濃度添加于細胞培養(yǎng)板中，用于抑制雜菌的生長。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

在超凈工作臺將培養(yǎng)好的供試菌株分別接種于裝有 250 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床上(37 ℃，180 r/min )振蕩培養(yǎng) 48 h，獲得發(fā)酵液。

1.3.2 提取菌株活性成分

將上述得到的生防菌株發(fā)酵液用等體積石油醚萃取三次，合并萃取物，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到的干燥物用無水乙醇溶解。

1.3.3 線蟲的培養(yǎng)

將灰葡萄孢菌接種到PDA培養(yǎng)平板上，放置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長滿全皿。在超凈工作臺中將松材線蟲接種于灰葡萄孢平板上，于25℃培養(yǎng) 10 d。采用貝爾曼漏斗法分離線蟲，10 h后將收集得到的線蟲液在離心機中離心(4 000 r/min，5 min)去掉雜質(zhì)后，用M9緩沖液稀釋線蟲液，重復3次，最后收取到線蟲液。

1.3.4 10株生防菌株對松材線蟲殺蟲活性測定

將對根結(jié)線蟲有較好防治效果的10株生防菌(編號分別為A4、A12、A15、A16、A18、B3、B9、B12、D1、D4)，發(fā)酵48 h后離心，10 000 rpm, 20 min,取上清液，稀釋不同的濃度，包括上清原液、稀釋2倍、稀釋10倍、稀釋50倍等濃度梯度，對松材線蟲進行室內(nèi)防治試驗。向96孔細胞培養(yǎng)板每個孔里依次加入3 μL氯霉素(2 mg/mL)，1 μL鏈霉素(100 mg/mL)，處理組加入200 μL 不同濃度上清液，對照組加入200 μL M9緩沖液，最后加入30條左右的松材線蟲，每個處理設三個重復，24 h后觀察并計算松材線蟲線蟲致死率。

1.3.5 菌株A4發(fā)酵乙醇抽提物對松材線蟲LC50值測定

選取室內(nèi)殺蟲活性最好的A4菌株為試驗對象。先用M9緩沖液將培養(yǎng)好的松材線蟲洗入離心管中制成蟲液，向1.5 mL的離心管中加入0.5 mL 1.8%的水瓊脂，待其凝固后加入1ul松材線蟲液(約30條)，在離心管蓋上放入圓濾紙片，分別向濾紙片上滴加濃度為0.168 、0.252、0.336、0.418、0.502、0.585、0.669、0.752、0.836 mg/mL的A4發(fā)酵乙醇抽提物各1 μl，以等量無水乙醇為對照。用封口膜將其密封后，避光放置于20 ℃培養(yǎng)箱，24 h后測定A4發(fā)酵乙醇抽提物熏蒸殺蟲活性。

1.3.6 菌株A4發(fā)酵乙醇抽提物在林間的殺蟲活性測定

將菌株A4經(jīng)48 h發(fā)酵后得發(fā)酵液10 L，發(fā)酵液用乙醇抽提后用于林間試驗。選擇武漢蔡甸區(qū)和江夏區(qū)2個試驗點，共1.6 hm2的松林進行松材線蟲病防治試驗。蔡甸區(qū)試驗地 0.8 hm2，為馬尾松純林，其中防治區(qū)0.5 hm2，對照區(qū)0.3 hm2；江夏區(qū)試驗地0.8 hm2，為馬尾松純林，其中防治區(qū)0.5 hm2，對照區(qū)0.3 hm2。在2018年5月施藥，10月調(diào)查林間發(fā)病情況，統(tǒng)計松材線蟲病枯死株數(shù)，計算防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 10株生防菌株對松材線蟲殺蟲活性測定

室內(nèi)殺蟲活性測定實驗結(jié)果顯示，10株生防菌株的發(fā)酵原液對松材線蟲均有很好的殺蟲活性；當將原液稀釋2倍后，菌株A4、A15、B3、B9、D1、D4仍然具有大于50%的殺蟲活性；當將原液稀釋10倍后，菌株A4的殺蟲活性依然高于50%(圖1)，此結(jié)果表明菌株A4具有更好的室內(nèi)殺蟲活性。

圖1 10株生防菌不同濃度梯度發(fā)酵液對松材線蟲殺蟲活性的測定

2.2 菌株A4發(fā)酵抽提物對松材線蟲LC50值測定

菌株A4發(fā)酵乙醇抽提物對松材線蟲的致死率見表1。由DPS軟件計算得出回歸方程為y=6.75x+8.61，相關系數(shù)R2= 0.978，LC50值為0.291 mg/mL。在光學顯微鏡下觀察松材線蟲的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與正常的活體蟲態(tài)相比，經(jīng)發(fā)酵液處理后的松材線蟲蟲體僵直，體內(nèi)出現(xiàn)異常泡狀物。該實驗表明菌株A4的發(fā)酵液對松材線蟲的致死中濃度是0.291 mg/mL，能夠作用于松材線蟲，起到殺死蟲體的效果。

表1 菌株A4發(fā)酵抽提物對松材線蟲LC50值測定

2.3 菌株A4發(fā)酵抽提物在林間的殺蟲活性測定

由表2可知，在蔡甸，防治區(qū)的松樹枯死率為3.33%，對照區(qū)的則為7.00%，與對照區(qū)相比，防治區(qū)的松樹枯死率下降了52.43%；在江夏，防治區(qū)的松樹枯死率為2.00%，對照區(qū)的為5.00%，與對照區(qū)相比，防治區(qū)的松樹枯死率下降了60.00%，該結(jié)果表明，菌株A4的發(fā)酵乙醇抽提物在林間有較好的防治效果，能夠有效降低林間的松樹枯死率，為松材線蟲病林間防治工作提供了數(shù)據(jù)參考。

表2 菌株A4發(fā)酵抽提物對松材線蟲病防治效果

3 結(jié)論與討論

生物防治由于具有對環(huán)境友好，不易產(chǎn)生抗藥性和防治效果較好等優(yōu)點，已成為病害防治研究熱點。生物防治在松材線蟲病的定義上是指通過引入能夠捕食線蟲或者產(chǎn)生毒素殺死線蟲或使得線蟲的致病力顯著降低的生物來達到有效降低病害的手段[5,6,7]。當前被用來進行植物線蟲防治的生物包括真菌、細菌、病毒、捕食性線蟲、昆蟲和螨類等[8,9,10]，其中細菌由于具有易培養(yǎng)、繁殖速度快等優(yōu)點，在松材線蟲的生物防治中占有重要的地位[7]。據(jù)現(xiàn)有報導顯示，對線蟲有拮抗活性的細菌種類包括有芽孢桿菌類、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌和根際細菌等[11,12]。

本研究的實驗對象即為10株對根結(jié)線蟲有較好拮抗作用的生防細菌，室內(nèi)殺蟲活性測定實驗結(jié)果表明這10個菌株的發(fā)酵原液都具有很好的殺蟲效果，當將發(fā)酵液稀釋2倍、10倍后仍然有菌株表現(xiàn)出較好的拮抗活性，其中菌株A4在發(fā)酵液被稀釋10倍后仍然具有大于50%的殺蟲活性，說明該菌株有很好的生防潛力。經(jīng)顯微結(jié)構觀察和16SrDNA測序鑒定后發(fā)現(xiàn)該菌株為短小芽孢桿菌。芽孢桿菌類細菌對松材線蟲具有殺蟲活性的報導已屢見不鮮，徐華潮等發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌的晶體蛋白對松材線蟲有很好的殺蟲活性[13]。郝穎等研究表明一株蠟狀芽孢桿菌能夠通過分泌具有熱穩(wěn)定的活性物質(zhì)來殺死線蟲[14]。朱麗梅等篩選到1株解淀粉芽孢桿菌，其發(fā)酵液的殺線蟲活性即使在稀釋10倍后仍然高達98.5%[15]。牛秋紅等從土壤分離得到的芽孢桿菌NS-3，其培養(yǎng)濾液的殺蟲活性不高，但濾液的蛋白粗提物卻具有很好的殺蟲活性[16]。這些研究結(jié)果表明芽孢桿菌類細菌在松材線蟲的生物防治方面占有相當?shù)谋壤瑫r不同種類的芽孢桿菌其殺線蟲的作用機理也有差別，有的活性物質(zhì)存在于發(fā)酵濾液中，有的存在于蛋白粗提物中，表明作用于松材線蟲的有效物質(zhì)可能是芽孢桿菌分泌的毒素或者某些蛋白酶類。在本研究中，將被殺死的線蟲在顯微鏡下觀察其生理結(jié)構，發(fā)現(xiàn)蟲體內(nèi)部出現(xiàn)空泡，其頭部、體壁和尾部均有損傷，提示菌株A4的活性物質(zhì)能夠造成線蟲內(nèi)容物的消解，但具體的作用機理和活性物質(zhì)的種類鑒定還需要進一步的實驗探索。

在菌株A4發(fā)酵抽提物的林間防治試驗中，與對照區(qū)相比，防治區(qū)的松樹枯死率明顯降低，表明該活性物質(zhì)在林間性質(zhì)穩(wěn)定，能夠起到較好的防治作用。林間防效通常會受到林間因子，如溫度、濕度、林分特點等，以及施藥方式、施藥濃度、施藥頻率等因子的影響，而本研究僅初步測定了其林間防效且防治區(qū)域有限，盡管取得了較好的防治效果，仍需進一步優(yōu)化其生產(chǎn)工藝，在推廣運用前還需開展更加細致地林間試驗。