扶正化瘀膠囊對氣虛血瘀型肝纖維化模型大鼠細(xì)胞自噬基因LC3Ⅱ和p62的干預(yù)作用

徐渴陽 蘇曉倩 包劍鋒

肝纖維化是病毒、酒精、脂肪等各種致病因子所致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，及早阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化是防治肝硬化的關(guān)鍵[1]。肝纖維化屬于中醫(yī)“脅痛”、“臌脹”、“積聚”等范疇，肝纖維化患者中，臨床以氣虛血瘀型最為多見。細(xì)胞自噬是指細(xì)胞在受到內(nèi)外環(huán)境刺激后，通過包裹自身受損蛋白質(zhì)、細(xì)胞器形成自噬小體后自我消化，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和應(yīng)對刺激因素的生化過程。而細(xì)胞自噬可誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞激活，促進肝纖維化進展[2]。有研究提示細(xì)胞自噬與氣虛血瘀相關(guān)，氣虛則精微物質(zhì)不足，通過自噬消化胞內(nèi)多余或損傷的細(xì)胞（血瘀等實邪）代為補償[3]。LC3Ⅱ是自噬標(biāo)志蛋白，可抑制肝星狀細(xì)胞活化，進而抑制肝纖維化[4]。而p62是一種寡聚蛋白質(zhì)，通過與自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ結(jié)合，從而被選擇性自噬降解[5]。扶正化瘀膠囊可益精養(yǎng)肝、活血祛瘀，具有一定的抑制肝纖維化作用[6]。本研究旨在，明確細(xì)胞自噬基因LC3Ⅱ、p62與氣虛血瘀型肝纖維化的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 清潔級SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量（150±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[合格證號：SYXK（浙）2013-0184]提供，預(yù)養(yǎng) 7天后進入實驗階段。飼養(yǎng)期間給與給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及自由飲水，12h循環(huán)黑白燈光，恒定溫濕度。

1.2 藥品及試劑 四氯化碳（CCl4，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號20160621）；橄欖油（由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號20161111）；扶正化瘀膠囊（由上海黃海制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號161103）；LC3Ⅱ上游引物 5’-GATGTCCGACTTATTC GAGAGC-3’,下游引物 5’-TTGAGCTGTAAGCGCCT TCTA-3’；p62 上游引物 5’-ATCAGCTTCTGGTCCAT CGG-3’，下游引物 5’-GCTTCTTTTCCCTGTGCT-3’；β-actin 上游引物 5’-CCCATCTATGAGGGTTAC GC-3’，下游引物 5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’；（引物由上海桑尼生物科技有限公司設(shè)計合成）；Anti-SQSTM1/p62 antibody：Abcam，批號ab56416；Anti-LC3B antibody：Sigma，批號 L7543；Anti-GAPDH antibody：聯(lián)科，批號 mab5465。

2 實驗方法

2.1 分 組 將40只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為四組：正常組、肝纖維化組、氣虛血瘀肝纖維化組和扶正化瘀治療組，每組10只。

2.2 模型制備 肝纖維化模型制備：將CCl4與橄欖油按4：6比例配40%油劑。按0.3mL/100g劑量，對肝纖維化組、氣虛血瘀肝纖維化組、扶正化瘀治療組大鼠予以皮下注射，每周2次，連續(xù)6周。氣虛血瘀型肝纖維化模型制備：在肝纖維化模型制備的基礎(chǔ)上，氣虛血瘀肝纖維化組及扶正化瘀治療組大鼠自第4周始加用游泳疲勞試驗，將肝纖維化大鼠放入水溫10°C、四壁光滑的大水桶中，連續(xù)游泳，至疲勞后下沉為止，早晚2次，持續(xù)造模2周。本課題組前期對肝纖維化模型、氣虛血瘀肝纖維化模型的制備積累了豐富經(jīng)驗，并基于這兩個模型發(fā)表論文多篇[7-8]。

2.3 藥物干預(yù) 7周始，正常組、肝纖維化組、氣虛血瘀肝纖維化組大鼠予以生理鹽水2mL灌胃，1天1次，連續(xù)4周。扶正化瘀治療組大鼠用藥劑量按照實驗動物研究“等效劑量”的計算方法，給予扶正化瘀膠囊，按0.5g/kg體質(zhì)量灌胃，藥物用生理鹽水按0.5g/mL濃度配比，1天1次，連續(xù)用藥4周。中藥干預(yù)過程中，觀察大鼠行精神狀況、活動情況、毛發(fā)、食欲及大便性狀等。

2.4 標(biāo)本采集和處理 10周末療程結(jié)束后處死全部大鼠，獲取肝組織標(biāo)本。取大鼠肝臟右葉，立即用10%中性磷酸緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）福爾馬林液中固定24h，按 1cm×1cm×0.2cm大小取材，標(biāo)記后流水沖洗30min，梯度酒精脫水，二甲苯透明后浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，予蘇木素-伊紅染色和苦味酸-天狼星紅染色。蘇木素-伊紅染色觀察肝組織炎癥、細(xì)胞變性和纖維化情況，苦味酸-天狼星紅染色顯示肝組織膠原纖維增生情況，兩者對照，判定肝組織纖維化程度，采用Ishak評分評價各組肝臟纖維化程度[8]。余組織液氮冷凍備份。

2.5 RT-PCR Trizol-離心柱法提取肝組織總RNA，測定RNA純度和含量，反轉(zhuǎn)錄、擴增后對LC3II、p62 mRNA定量。mRNA相對表達(dá)量公式如下：mRNA 相對表達(dá)量=靶 mRNA/βactin。

2.6 Western blot根據(jù)樣本細(xì)胞量加入 100μL IP裂解液裂提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，隨后聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜，最后ECL化學(xué)發(fā)光顯影，分別檢測LC3II、p62、GAPDH 蛋白表達(dá)。Western blot采用 Image J軟件計算灰度值，公式如下：靶蛋白相對表達(dá)量=靶蛋白/GAPDH。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（s） 表示，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量及肝濕重情況 氣虛血瘀肝纖維化組大鼠體質(zhì)量及肝濕重最低（P＜0.05），經(jīng)扶正化瘀治療后接近正常水平（P＜0.05），見表1。

3.2 各組大鼠肝組織天狼星紅染色 正常組肝細(xì)胞排列整齊，無纖維增生；肝纖維化組：可見較為明顯的紅色膠原纖維,肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，可見部分假小葉；氣虛血瘀肝纖維化組可見明顯的紅色膠原纖維，橋接樣壞死，可見大面積假小葉；扶正化瘀治療組可見紅色膠原纖維有所減少，見插頁圖1。

3.3 各組大鼠肝纖維化Ishak評分比較 氣虛血瘀肝纖維化組炎癥評分、肝纖維化評分以及Ishak評分均高于肝纖維化組（P＜0.05），經(jīng)扶正化瘀軟膠囊治療后，評分均有所降低（P＜0.05），見表 2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肝濕重情況（g

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肝濕重情況（g

注：與正常組比較，*P＜0.05；與肝纖維化組比較，△P＜0.05；與氣虛血瘀肝纖維化組比較，▲P＜0.05；正常組、肝纖維化組、氣虛血瘀肝纖維化組給予生理鹽水灌胃；扶正化瘀治療組給予0.5g/kg體質(zhì)量扶正化瘀膠囊混懸液灌胃

組別正常組肝纖維化組氣虛血瘀肝纖維化組扶正化瘀治療組鼠數(shù)10 10 10 10體質(zhì)量423.40±30.18 391.50±24.52*356.10±20.45*△375.80±24.36*▲肝濕重10.95±0.85 11.52±0.95 10.34±1.13△11.31±1.13▲

表2 各組大鼠肝纖維化Ishak評分比較（分

表2 各組大鼠肝纖維化Ishak評分比較（分

注：與正常組比較，*P＜0.05；與肝纖維化組比較，△P＜0.05；與氣虛血瘀肝纖維化組比較，▲P＜0.05；正常組、肝纖維化組、氣虛血瘀肝纖維化組給予生理鹽水灌胃；扶正化瘀治療組給予0.5g/kg體質(zhì)量扶正化瘀膠囊混懸液灌胃

組別正常組肝纖維化組氣虛血瘀肝纖維化組扶正化瘀治療組鼠數(shù)10 10 10 10炎癥壞死評分0 11.80±1.80*14.20±1.70*△10.20±1.50*▲肝纖維化評分0 3.90±1.20*5.80±0.80*△2.70±0.90*▲

3.4 各組大鼠LC3Ⅱ、p62 mRNA表達(dá)水平比較LC3ⅡmRNA表達(dá)在氣虛血瘀肝纖維化組最高，經(jīng)扶正化瘀軟膠囊治療后顯著下降（P＜0.05）；而p62 mRNA在氣虛血瘀肝纖維化組最低，經(jīng)扶正化瘀軟膠囊治療后顯著升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠LC3Ⅱ、p62 mRNA表達(dá)水平比較（

表3 各組大鼠LC3Ⅱ、p62 mRNA表達(dá)水平比較（

注：與正常組比較，*P＜0.05；與肝纖維化組比較，△P＜0.05；與氣虛血瘀肝纖維化組比較，▲P＜0.05；正常組、肝纖維化組、氣虛血瘀肝纖維化組給予生理鹽水灌胃；扶正化瘀治療組給予0.5g/kg體質(zhì)量扶正化瘀膠囊混懸液灌胃

組別正常組肝纖維化組氣虛血瘀肝纖維化組扶正化瘀治療組鼠數(shù)10 10 10 10 LC3Ⅱ1.10±0.03 1.23±0.01*1.44±0.01*△1.20±0.01*▲P62 1.20±0.06 1.10±0.01*0.95±0.05*△1.12±0.01*▲

3.5 各組大鼠LC3Ⅱ、p62蛋白表達(dá)水平比較 LC3Ⅱ 蛋白表達(dá)在氣虛血瘀肝纖維化組最高，經(jīng)扶正化瘀軟膠囊治療后顯著下降（P＜0.05）；p62蛋白在在氣虛血瘀肝纖維化組最低，經(jīng)扶正化瘀軟膠囊治療后顯著升高（P＜0.05），見表 4、插頁圖 2。

4 討論

研究表明，細(xì)胞自噬可造成脂滴降解為肝星狀細(xì)胞活化提供ATP，進而肝星狀細(xì)胞持續(xù)活化促進肝纖維化進展[9]。LC3Ⅱ作為細(xì)胞自噬蛋白，可通過調(diào)控p62介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化[10]。而細(xì)胞自噬的病理生理機制與中醫(yī)氣虛血瘀證相關(guān)，并通過補氣活血方取得一定療效[11]。本研究結(jié)果顯示，氣虛血瘀組LC3Ⅱ表達(dá)最高，下游蛋白p62表達(dá)最低，提示氣虛血瘀細(xì)胞自噬水平升高。而通過扶正化瘀膠囊益氣扶元、活血化瘀，下調(diào)細(xì)胞自噬蛋白LC3Ⅱ，上調(diào)p62，可抑制細(xì)胞自噬水平。

表4 各組大鼠LC3Ⅱ、p62蛋白相對表達(dá)水平比較

表4 各組大鼠LC3Ⅱ、p62蛋白相對表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與肝纖維化組比較，△P＜0.05；與氣虛血瘀肝纖維化組比較，▲P＜0.05；正常組、肝纖維化組、氣虛血瘀肝纖維化組給予生理鹽水灌胃；扶正化瘀治療組給予0.5g/kg體質(zhì)量扶正化瘀膠囊混懸液灌胃

組別正常組肝纖維化組氣虛血瘀肝纖維化組扶正化瘀治療組鼠數(shù)10 10 10 10 LC3Ⅱ1.84±0.21 2.63±0.35*3.01±0.57**△2.04±0.30△▲P62 1.10±0.23 0.38±0.17**0.19±0.12**△0.67±0.32△▲

中醫(yī)認(rèn)為，細(xì)胞自噬多以陰陽、虛實為基礎(chǔ)[12-14]。黃貴華等[3]認(rèn)為，自噬是對機體正虛邪實作出的一種自我調(diào)節(jié)方式。自噬既是正氣虧虛下的自救方式，同時也是機體轉(zhuǎn)化、消除內(nèi)生實邪（如痰濁、瘀血等）的方式。劉杰民等[12]認(rèn)為，細(xì)胞自噬與機體臟腑功能失調(diào)下，內(nèi)生痰濁瘀血之實邪的自我清除以維持內(nèi)環(huán)境的陰陽平衡，以及中醫(yī)氣虛情況下通過“精化氣”，以維持機體生命活動的機制相一致。人體是一個有機的整體，《素問·生氣通天論》說，“陰平陽秘精神乃治”，正常狀態(tài)下細(xì)胞自噬處于基礎(chǔ)水平，陰長陽消、陰消陽長，使機體細(xì)胞處于穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞自噬太過、自噬蛋白LC3Ⅱ蓄集則血瘀，而自噬底物p62消耗太過則氣虛。氣虛則推動無力，容易導(dǎo)致病理產(chǎn)物L(fēng)C3Ⅱ堆積，而病理產(chǎn)物的堆積又會使氣機不調(diào)，加重氣虛。正如肝纖維化形成后細(xì)胞自噬反而呈活躍狀態(tài)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，氣虛血瘀肝纖維化大鼠細(xì)胞自噬蛋白LC3Ⅱ表達(dá)增加，促使自噬底物p62表達(dá)減少。扶正化瘀膠囊干預(yù)可以抑制細(xì)胞自噬水平改善肝纖維化程度。

圖1 肝組織天狼星紅染色（×200）

圖2 WB條帶