ABCG2在非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥中的作用研究

王雷 王明吉 黃磊 代璐璐 李顏君 鄭玉軍

[摘要]目的 研究ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族G成員2（ABCG2）在非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥中的作用，對吉非替尼耐藥的非小細(xì)胞肺癌治療提供依據(jù)。方法 培養(yǎng)人肺腺癌吉非替尼敏感細(xì)胞株A549及吉非替尼耐藥的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/GR，A549/GR細(xì)胞的耐藥性檢測應(yīng)用MTT法。用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測被吉非替尼作用的A549/GR細(xì)胞及A549細(xì)胞中的ABCG2、p-AKT蛋白的表達(dá)情況。分別加入磷醇酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）通路激活劑胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及抑制劑LY294002，分析作用于上述兩種細(xì)胞的p-AKT、ABCG2蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定A549及A549/GR細(xì)胞株中的ABCG2外排情況。收集2015年4月～2017年4月我院收治的非小細(xì)胞肺癌患者及健康人血清，分為非小細(xì)胞肺癌非耐藥組（20例）、非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥組（20例）和健康者組（20例）。應(yīng)用ELISA法檢測三組的ABCG2表達(dá)。結(jié)果 隨著劑量的增加，吉非替尼對A549細(xì)胞及A549/GR細(xì)胞的抑制作用均增強(qiáng)（P<0.05）。A549/GR的耐藥指數(shù)為13.4。Western Blot檢測耐藥相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于親代細(xì)胞A549。IGF-1作用的A549細(xì)胞，p-AKT、ABCG2蛋白表達(dá)均提高（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細(xì)胞，p-AKT、ABCG2均下調(diào)（P<0.05）。IGF-1作用A549細(xì)胞后，較未加入激活劑的A549細(xì)胞，其外排作用增強(qiáng)（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細(xì)胞后，較未加入激活劑的A549/GR細(xì)胞，其外排作用減少（P<0.05）。健康人的ABCG2表達(dá)明顯低于非小細(xì)胞肺癌非耐藥組患者（P<0.05），非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥組患者的ABCG2表達(dá)均高于非小細(xì)胞肺癌非耐藥組患者及健康人（P<0.05）。結(jié)論 在非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥中ABCG2起到了重要的作用，逆轉(zhuǎn)ABCG2介導(dǎo)的NSCLC靶向耐藥主要通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路。

[關(guān)鍵詞] ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族G成員2;非小細(xì)胞肺癌;吉非替尼;耐藥;磷醇酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶

[中圖分類號] R979.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）3（b）-0009-05

肺癌是近年來發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-samll cell lung cancer，NSCLC）占80%～90%[1-2]。吉非替尼是第一代表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosinekinase inhibitor，EGFR-TKI）類藥物，是治療晚期NSCLC EGFR突變?nèi)巳旱氖滓x擇，但治療后大部分患者會產(chǎn)生獲得性耐藥[3-4]。ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族G成員2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）通過外排泵作用，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化療藥物主動(dòng)外排，參與多種腫瘤耐藥機(jī)制[5-6]。既往研究表明[7-8]，耐厄洛替尼的人肺腺癌細(xì)胞株（A549/ER）相對于A549細(xì)胞株ABCG2表達(dá)升高，由于厄洛替尼與吉非替尼均屬于EGFR-TKI類藥物，但其藥理學(xué)特性不同，所以吉非替尼的耐藥亦可能與ABCG2有關(guān)。本課題通過對ABCG2在NSCLC吉非替尼耐藥中的作用及其介導(dǎo)耐藥的信號路徑的研究，對于吉非替尼耐藥的NSCLC的治療有重要意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞材料? 人非小細(xì)胞肺腺癌吉非替尼敏感細(xì)胞株A549購自上海復(fù)祥生物科技有限公司，吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549/GR由本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)所得。

1.1.2 一般資料? 收集2015年4月～2017年4月我院收治的NSCLC患者及健康人的血清，分為NSCLC非耐藥組（20例）、NSCLC吉非替尼耐藥組（20例）和健康者組（20例）。NSCLC非耐藥組研究對象的年齡39～80歲;男7例，女13例;腺癌17例，鱗癌2例，腺鱗癌1例。NSCLC吉非替尼耐藥組研究對象的年齡43～76歲;男5例，女15例;腺癌19例，腺鱗癌1例。健康者組研究對象的年齡31～75歲，男9例，女11例。三組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核及同意。

1.1.3藥品與試劑? 吉非替尼購自阿斯利康公司（250 mg/片）。一抗：GAPDH（武漢博士德公司）;ABCG2（Abcam公司）;p-AKT（Abcam公司）;二抗：辣根過氧化物酶（漢博士德公司）;PRMI1640培養(yǎng)基及胎牛血（Hyclone公司）;MTT（Sigma公司）;ABCG2酶聯(lián)免疫分析試劑盒（cusabio公司）。Thermo Multikan MK3酶標(biāo)儀（Thermo公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)? 將A549細(xì)胞株應(yīng)用含10%胎牛血清的PRMI1640于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行養(yǎng)育。將A549/GR細(xì)胞株置于含有濃度為1 μmol/L吉非替尼的10%胎牛血清的PRMI1640，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)對象為對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 A549/GR細(xì)胞的耐藥性檢測? 將A549及A549/GR細(xì)胞分別加入100 μl呈半數(shù)藥物濃度梯度的培養(yǎng)基，各設(shè)置7個(gè)濃度梯度組（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）及空白對照組，培養(yǎng)后加入MTT，濃度5 mg/ml，培養(yǎng)4 h后，吸出培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），輕微振蕩后用酶標(biāo)儀檢測吸光度（A）值（波長490 nm）。用下列公式進(jìn)行計(jì)算：

細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值）×100%，耐藥指數(shù)=耐藥細(xì)胞半抑制濃度（IC50）/親代細(xì)胞IC50

1.2.3 ABCG2、p-AKT蛋白在A549、A549/GR細(xì)胞的表達(dá)? 用吉非替尼分別處理A549、A549/GR，細(xì)胞裂解后，提取總蛋白，應(yīng)用BCA法行蛋白定量。在120 V下持續(xù)電泳至樣品到達(dá)凝膠底部。半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，洗膜后，剪下相應(yīng)條帶，分別放入GAPDH、ABCG2、p-AKT多克隆一抗中（1∶1000稀釋），4℃冰箱孵育過夜。次日，將PVDF膜從一抗中取出，洗膜緩沖液（TBST）洗脫3次，置于二抗（1∶2000稀釋）中，于搖床上搖動(dòng)，洗脫3次。最后將配好的電化學(xué)發(fā)光（ECL）液滴加覆蓋PVDF膜。使用超靈敏化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行曝光，選擇合適曝光時(shí)間，觀察分析曝光的條帶情況。

用濃度為100 ng/ml的胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及濃度為20 μmol/L的LY294002分別處理A549、A549/GR細(xì)胞48 h，用上述同樣方法檢測蛋白的表達(dá)。

1.2.4檢測細(xì)胞中ABCG2外排? 取A549細(xì)胞及A549/GR細(xì)胞作為對照，在A549細(xì)胞和A549/GR細(xì)胞中分別加入IGF-1、LY294002，將4組細(xì)胞各加入1 μg/ml Rh123培養(yǎng)24 h，使用流式細(xì)胞儀檢測ABCG2外排情況。

1.2.5檢測健康人、NSCLC非耐藥組及非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥組患者中ABCG2表達(dá)? 收集患者清晨空腹靜脈血，靜置取上層血清，按酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒操作說明，進(jìn)行ELISA檢測血清中ABCG2水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組建比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 A549/GR細(xì)胞的耐藥性檢測

吉非替尼對A549細(xì)胞及A549/GR細(xì)胞的抑制作用，隨濃度的升高而增強(qiáng)（P<0.05）。濃度相同，A549/GR的細(xì)胞存活率高于A549細(xì)胞（圖1）。吉非替尼對A549/GR的IC50為47 μmol/L，吉非替尼對A549細(xì)胞的IC50為3.5 μmol/L，耐藥指數(shù)為13.4。

與同組前一個(gè)濃度比較，*P<0.05

2.2 ABCG2、p-AKT蛋白在A549、A549/GR細(xì)胞的表達(dá)

Western Blot檢測耐藥相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于親代細(xì)胞A549（圖2）。

IGF-1作用的A549細(xì)胞、p-AKT、ABCG2蛋白表達(dá)提高（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細(xì)胞、p-AKT、ABCG2均下調(diào)（P<0.05）（圖3）。

2.3檢測細(xì)胞中ABCG2外排

IGF-1作用A549細(xì)胞后，較未加入激活劑的A549細(xì)胞，其外排作用增強(qiáng)（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細(xì)胞后，較未加入激活劑的A549/GR細(xì)胞，其外排作用減少（P<0.05）（圖4）。

2.4檢測健康人、NSCLC非耐藥組及NSCLC吉非替尼耐藥組患者中ABCG2表達(dá)

檢測健康人、NSCLC非耐藥組及NSCLC吉非替尼耐藥組患者的ABCG2表達(dá)分別為（98.6±6.8）ng/ml、（209.5±8.2）ng/ml及（326.7±10.3）ng/ml。健康人的ABCG2表達(dá)明顯低于NSCLC非耐藥組患者（P<0.05），NSCLC吉非替尼耐藥組患者的ABCG2表達(dá)均高于NSCLC非耐藥組患者及健康人（P<0.05）。

3討論

EGFR-TKI是目前晚期NSCLC EGFR突變患者的一線治療選擇，其耐藥機(jī)制已成為臨床研究的重點(diǎn)。早在1970年Biedler等[9]就首次報(bào)道腫瘤存在多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象。癌細(xì)胞多藥耐藥性形成的重要原因是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的異常表達(dá)[10-11]。人類基因組編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體有49個(gè)，包括A～G 7個(gè)亞家族，其中最少有16個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體已被證實(shí)具有藥物外排功能[12]。ABCG2屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族中的一員，最早是在乳腺癌耐藥細(xì)胞株中被發(fā)現(xiàn)，是一種半轉(zhuǎn)運(yùn)體[13]。有研究證實(shí)ABCG2與吉非替尼、厄洛替尼等相結(jié)合可導(dǎo)致藥物主動(dòng)外排到胞外，進(jìn)而抑制其生物活性，產(chǎn)生耐藥[14-15]。本研究著重于探討ABCG2 在吉非替尼耐藥的非小細(xì)胞肺癌中作用及其調(diào)控耐藥的機(jī)制。

Ho等[16]從H460、H23、HTB-58、A549、H441、H2170六種肺癌細(xì)胞系中分離出的側(cè)群細(xì)胞中ABCG2高表達(dá)。一項(xiàng)中國臺灣的研究顯示[17]，對于吉非替尼耐藥的EGFR野生型的非小細(xì)胞肺癌中，其耐藥與ABCG2相關(guān)，而且ABCG2表達(dá)過多可提示對吉非替尼的療效差。本研究結(jié)果提示，Western Blot檢測耐藥相關(guān)蛋白，耐藥細(xì)胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于親代細(xì)胞A549，證明了耐藥細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)要明顯高于正常腫瘤細(xì)胞（P<0.05）。與以上研究基本一致，但本課題缺乏對ABCG2影響腫瘤治療預(yù)后的研究，有待進(jìn)一步的研究。

磷醇酰肌醇3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phpsphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）通路激活劑IGF-1可在體外激活PI3K/AKT信號通路，激活A(yù)KT活化，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，促進(jìn)血管生成，提高腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[18-19]。PI3K/AKT通路抑制劑LY294002為一種高效的AKT激酶選擇性抑制劑，可使吉非替尼耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株逆轉(zhuǎn)耐藥[20]。本研究利用加入PI3K/AKT通路激活劑和抑制劑的細(xì)胞通過RH123外排的檢測來明確ABCG2外排情況。研究結(jié)果提示，IGF-1作用的A549細(xì)胞，p-AKT、ABCG2蛋白表達(dá)均提高（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細(xì)胞，p-AKT、ABCG2均下調(diào)（P<0.05）。IGF-1作用A549細(xì)胞后，較未加入激活劑的A549細(xì)胞，其外排作用增強(qiáng)（P<0.05）。LY294002作用A549/GR細(xì)胞后，較未加入激活劑的A549/GR細(xì)胞，其外排作用減少（P<0.05）。提示PI3K/AKT激活劑和抑制劑可以調(diào)節(jié)Rh123的外排，故PI3K/AKT通路可能調(diào)節(jié)ABCG2的表達(dá)，與既往研究一致。

有報(bào)道[21-22]提示肺癌干細(xì)胞中ABCG2高表達(dá)，并與肺癌的耐藥相關(guān)。另外一項(xiàng)研究結(jié)果提示[23]，手術(shù)前后NSCLC患者的ABCG2的表達(dá)，可見未手術(shù)的NSCLC患者血清中ABCG2的表達(dá)高于健康人及術(shù)后患者。本研究結(jié)果提示，健康人的ABCG2表達(dá)明顯低于NSCLC非耐藥組患者（P<0.05），NSCLC吉非替尼耐藥組患者的ABCG2表達(dá)均高于NSCLC非耐藥組患者及健康人（P<0.05）。證實(shí)ABCG2在NSCLC中要高于健康人群，吉非替尼耐藥的NSCLC的表達(dá)高于NSCLC的人群。由此研究可見，ABCG2可作為吉非替尼耐藥NSCLC的重要標(biāo)記，對于預(yù)測耐藥及指導(dǎo)后續(xù)耐藥后治療至關(guān)重要。

綜上所述，ABCG2在NSCLC吉非替尼耐藥中起到了重要的作用，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ABCG2可作為預(yù)測EGFR-TKI耐藥的重要指標(biāo)，并證明了逆轉(zhuǎn)ABCG2介導(dǎo)的NSCLC 靶向耐藥主要通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，后在NSCLC的患者中驗(yàn)證了這一推測，但本研究仍然具有一定的局限性，并沒有行亞組及ABCG2與非小細(xì)胞肺癌患者治療療效及生存期的分析，值得進(jìn)一步的探討，為吉非替尼耐藥的NSCLC治療提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

[2]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016[J].CA Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

[3]鐘銳，鄔麟，江美林，等.EGFR-TKIs獲得性耐藥的機(jī)制及其治療的研究進(jìn)展[J].腫瘤藥學(xué)，2017，7（6）：641-647.

[4]劉紅柳，楊家梅.培美曲塞聯(lián)合吉非替尼治療EGFR-TKI耐藥后晚期非小細(xì)胞肺癌臨床觀察[J].中國癌癥雜志，2017， 27（2）：135-139.

[5]Guo J，Jin D，Wu Y，et al.The miR 495-UBE2C-ABCG2/ERCC1 axis reverses cisplatin resistance by downregulating drug resistance genes in cisplatin-resistant non-small cell lung cancer cells[J].Ebio Med，2018，35（9）：204-221.

[6]Zhang GN，Zhang YK，Wang YJ，et al.Epidermal growth factor receptor （EGFR） inhibitor PD153035 reverses ABCG2-mediated multidrug resistance in non-small cell lung cancer：In vitro and in vivo[J].Cancer Lett，2018，28（6）：19-29.

[7]張靖，馬虎，陳正堂，等.ABCG2在非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥中的作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（10）：987-991.

[8]Tang L，Zhang C，He H，et al.Associations between ABCG2 gene polymorphisms and gefitinib toxicity in non-small cell lung cancer：a meta-analysis[J].Onco Targets Ther，2018，11（1）：665-675.

[9]Biedler JL，Riehm H.Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro：cross-resistance，radioautographic，and cytogenetic studies[J].Cancer Res，1970，30（4）：1174-1184.

[10]Wu Q，Yang Z，Nie Y，et al.Muti-drug resistance in cancer chemotherapeutics：mechanisms and lab approaches[J].Cancer Lett，2014，347（2）：159-166.

[11]Xie T，Mo L，Li L，et al.Identification of side population cells in human lung adenocarcinoma A549 cell line and elucidation of the underlying roles in lung cancer[J].Oncol Lett，2018，15（4）：4900-4906.

[12]嚴(yán)曉麗，杜夢楠，鄭紀(jì)寧.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)microRNA 與腫瘤多藥耐藥的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2017，38（23）：3685-3688.

[13]王詩琦，劉克辛.外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體與腫瘤多藥耐藥[J].藥物評價(jià)研究，2018，41（6）：952-957.

[14]Hegedus C，Truta-Feles K，Antalffy G，et al.Interaction of the EGFR inhibitors gefitinib，vandetanib，pelitinib and neratinib with the ABCG2 multidrug transporter：implications for the emergence and reversal of cancer drug resistance[J].Biochem Pharmacol，2012，84（3）：260-267.

[15]Maricla G，Giorgio PP，Claudia F，et al.Effect of ABCG2/BCRP expression on efflux and uptake of gefitinib in NSCLC cell lines[J].PLoS One，2015，10（11）：e0141795.

[16]Ho MM，Ng AV，Lam S，et al.Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells[J].Cancer Res，2007，67（10）：4827-4833.

[17]Chen YJ，Huang WC，Huang MC，et al.Elecated BCRP/ABCG2 expression confers acquired resistance to gefitinib in wild-type EGFR-expressing cells[J].PLoS One，2011，6（6）：214-228.

[18]李靜，朱冰.PI3K/AKT信號通路與EGFR-TKIs治療NSCLC耐藥的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2018，47（17）：2340-2343.

[19]胡麗娜，彭興春，郭顯智，等.抑制Notch和PI3K/Akt信號通路對食管腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響[J].腫瘤防治研究，2016，43（8）：653-658.

[20]楊金成，陳福寶，周麗娟.LY294002對人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2018，40（10）：896-898.

[21]Hu J，Li J，Yue X，et al.Expression of the cancer stem cell markers ABCG2 and OCT-4 in right-sided colon cancer predicts recurrence and poor outcomes[J].Oncotarget，2017， 8（17）：28 463-28 470.

[22]賴紅錦，林鋒，陳楠，等.肺癌干細(xì)胞作為靶點(diǎn)的肺癌治療策略研究進(jìn)展[J].中國肺癌雜志，2018，21（1）：57-62.

[23]王大星，謝彤.手術(shù)前后非小細(xì)胞肺癌血清ABCG2水平的影響[J].中國癌癥防治雜志，2011，3（1）：56-58.

（收稿日期：2018-11-20? 本文編輯：孟慶卿）