HPLC法測(cè)定安胎飲合劑中黃芩苷的含量

鄒福賢 ，李 鷙 ，李 宇 ，李 丹 ，許 文 ，徐 偉 ，褚克丹

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福州市中醫(yī)院，福建 福州 350001）

安胎飲合劑為福州市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，在臨床上用于治療脾腎兩虛、氣血不足引起的胎漏、胎動(dòng)不安（先兆流產(chǎn)）等癥狀，療效可靠顯著。本方由黨參、菟絲子、黃芩等多味中藥組成，具有補(bǔ)腎健脾、固任安胎之功效，方中黃芩為清熱燥濕安胎之王，用于治療胎動(dòng)不安［1］。

黃芩苷是《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》（2015年版）中黃芩的含量測(cè)定指標(biāo)性成分［2］，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有治療心血管疾病、抗過敏、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用［3-8］，是安胎飲中的重要活性成分。本研究選取安胎飲合劑中黃芩的黃芩苷成分作為指標(biāo)性成分，建立高效液相色譜法，對(duì)安胎飲合劑中的黃芩苷進(jìn)行定量分析，為建立安胎飲合劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1290型超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；CPA225D型十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ-500DE臺(tái)式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥 安胎飲合劑（批號(hào)：20180315、20180322、20180329）；黃芩苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201720）；乙腈、甲酸為色譜純，超純水（美國(guó) Millipore公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Welch Ultimate XB-C18（5μm，250×4.6 mm），以乙腈∶0.1%甲酸水溶液＝30∶70（V／V）為流動(dòng)相，柱溫為 30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為 280 nm，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10μL。在此色譜條件下，基線平穩(wěn)，黃芩苷分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按黃芩苷計(jì)均大于5 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品4.84 mg，置5 mL量瓶中，加適量甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含有0.968 mg·mL-1黃芩苷的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取安胎飲合劑約1.0 g，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理 30 min（功率 250 W，頻率 50 kHz），放冷；再次稱重，50%甲醇補(bǔ)足減失重，搖勻，離心；再0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液用50%甲醇稀釋10倍，得供試品溶液。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 按照安胎飲合劑處方比例制備缺黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，同法制備相應(yīng)的陰性樣品溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜分析。結(jié)果供試品溶液色譜中，與對(duì)照品相同保留時(shí)間處有色譜峰，而陰性樣品溶液在相同保留時(shí)間處無(wú)色譜峰干擾，說明本方法專屬性良好，各色譜圖見圖1。

圖1 樣品色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別配制成含有黃芩苷0.484、0.968、2.420、4.840、9.680、19.360、29.040 μg／mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積。以黃芩苷的濃度為橫坐標(biāo)（X），以黃芩苷色譜峰峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得黃芩苷線性回歸方程：

表明黃芩苷在0.484～29.040μg·mL-1濃度范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，見圖2。

2.5 中間精密度試驗(yàn) 取同一批安胎飲合劑 （批號(hào)20180315），按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過不同時(shí)間和3個(gè)不同分析人員按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定黃芩苷的含量。結(jié)果不同時(shí)間檢測(cè)的黃芩苷含量RSD為0.90%，不同操作人員檢測(cè)的黃芩苷含量RSD為0.9%。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)方法具有較好的精密度。

圖2 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批安胎飲合劑（批號(hào)20180315）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃芩苷的含量，其平均含量為2.94 mg／g，RSD為1.0%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為20180315的安胎飲合劑，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 和 24 h 按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定黃芩苷的峰面積，結(jié)果RSD為0.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 取9份重復(fù)性實(shí)驗(yàn)同批安胎飲合劑，每份0.50 g，分為低、中、高3組，每組3份，分別為低-1、低-2、低-3、中-1、中-2、中-3、高-1、高-2、高-3，低組添加相當(dāng)于樣品中黃芩苷含量的50%，中組添加相當(dāng)于樣品中黃芩苷含量的100%，高組添加相當(dāng)于樣品中黃芩苷含量的150%，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算黃芩苷的回收率和RSD，結(jié)果見表1。加樣回收率在96.09%～106.1%，RSD小于3.0%。表明該方法回收率良好。

2.9 耐用性試驗(yàn) 取同一批安胎飲合劑（批號(hào)20180315）3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在不同柱溫25、30和35℃下，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的含量，結(jié)果無(wú)明顯差別；在不同流速調(diào)0.8、1.0 和 1.2 mL·min-1下，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的含量，結(jié)果無(wú)明顯差別；分別采用Ultimate XB-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）、DiamonsiL C18 （2）（5 μm，250×4.6 mm）和XSELECT CSH C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）3種不同色譜柱，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的含量，結(jié)果無(wú)明顯差別。上述各個(gè)條件下檢測(cè)出黃芩苷含量的RSD為0.5%。

2.10 含量測(cè)定 取不同批次安胎飲樣品各3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算安胎飲合劑中黃芩苷成分的含量，見表2。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

本研究前期對(duì)供試品溶液制備進(jìn)行考察，通過考察溶解樣品溶液的甲醇濃度、料液比進(jìn)而確定最佳前處理方法。首先考察了樣品溶液不同甲醇濃度（10%、30%、50%、70%和90%甲醇）作為溶劑的溶解效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%甲醇溶解效果較好（見圖3），故后期優(yōu)化選擇50%甲醇作為溶解溶劑。加入甲醇重量體積比主要考察了 1∶10、1∶30、1∶50、1∶70 和 1∶100，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)重量體積比達(dá)到1∶50時(shí)，檢測(cè)出的黃芩苷含量基本不變。見圖3。

圖3 供試品制備考察

關(guān)于檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，取對(duì)照品溶液和供試品溶液，利用DAD檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行190～400 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜全波長(zhǎng)掃描，黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，因此，選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。液相色譜條件參照中國(guó)藥典及其他黃芩苷含量測(cè)定相關(guān)研究［9-12］，最后優(yōu)化為乙腈-0.1%甲酸水溶液＝30∶70（V／V）為流動(dòng)相，等度洗脫，10 min 內(nèi)即可完成檢測(cè)。

本研究所建立的高效液相色譜法測(cè)定安胎飲合劑中黃芩苷含量，經(jīng)過分析方法學(xué)的驗(yàn)證，表明該方法快速、準(zhǔn)確，可用于安胎飲合劑的質(zhì)量控制。

致謝：本項(xiàng)目在福建省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、福建省中藥資源研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。