內蒙古呼和浩特市搖蚊鑒定與COI基因序列分析

元正菊，劉威，李楠，孟錦昕，何于雯，王靜林*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224； 2.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院，內蒙古 呼和浩特 010031)

搖蚊科(Chironomidae)屬于動物界、節(jié)肢動物門、六足亞門、昆蟲綱、有翅亞綱，隸屬雙翅目、長角亞目[1]。全世界廣泛分布，遍及各大動物地理分布區(qū)[2]。目前已被描述的搖蚊種類超過6000種[3]。搖蚊成蟲幾乎不取食，或者攝食少量含糖分的液體。幼蟲是水體中分布范圍廣的一類水生昆蟲，其中一些種類對水質的變化如營養(yǎng)鹽、重金屬、pH和溶解氧等極為敏感，另有些種類則適應有機污染、重金屬類毒物污染[4]。在水質的生物學評價工作中利用其種類敏感和耐污染特性，反應水質的變化和污染程度，是生物監(jiān)測的重要評價依據[4-6]。國內有關搖蚊的研究近年來多偏重于成蟲的分類學研究[4]，但專門研究報道的不多，缺乏完整、系統(tǒng)的資料。為此，2016年在內蒙古呼和浩特市采集搖蚊，并采用形態(tài)學和分子生物學方法對搖蚊進行了系統(tǒng)鑒定，報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集

2016年7月，在內蒙古呼和浩特市周圍農戶家牛圈采用誘蚊燈(功夫小帥，12 V，300 mA，湖北武漢) 進行標本采集[7]，采集時間段約為晚間18：00至次日早晨8：00，共14h。次日早晨將標本收集，置于-20℃冰箱中冷凍20～30min，待存活的搖蚊剛好冷凍至死后，取出標本，剔除其他昆蟲，將搖蚊標本置于70%乙醇中保存。

1.2 搖蚊形態(tài)學鑒定

從乙醇中取出搖蚊標本，在解剖顯微鏡下進行形態(tài)觀察，并進行計數。

1.3 DNA提取及PCR擴增

挑選形態(tài)完整、形態(tài)學鑒定為搖蚊的標本，浸泡在含有1%蛋白酶K的240μL浸儲液中，40℃消化過夜。用DNA提取試劑盒(天根公司)按說明書提取搖蚊DNA。操作步驟如下：將浸泡過夜的浸儲液全部移入無菌離心管中，加入20μL Proteinase K溶液，混勻，56℃放置10min；加200μL緩沖液GB和1μL Carrier RNA儲存液，混勻，70℃放置10min；加200μL無水乙醇充分混勻，過柱，分別用500μL緩沖液GD和600μL漂洗液PW洗滌。將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50μL洗脫緩沖液TB洗脫DNA。采用25μL體系，取2μL cDNA做反應模板，用COI特異引物[7]進行PCR擴增，依次加入10×Buffer 2.5μL、2.5mmol/L dNTP 2μL、上下引物各0.5μL、ddH2O 9.5μL,94℃預變性5min。94℃ 40s，47℃ 40s，72℃ 1min，5個循環(huán)。94℃ 40s，53℃ 40s，72℃1min，30個循環(huán)。72℃延伸10min。1%瓊脂糖電泳檢查擴增條帶，用TaKaRa DNA fragment Purification Kit純化PCR擴增產物，PCR擴增產物通過華大基因公司進行測序。

1.4 序列分析

使用Clustal X Version 2.1 軟件包進行病毒基因核苷酸序列比對， DNA Star軟件中MegAlign進行核苷酸同源性分析。使用MEGA 4.1 軟件完成基于最大似然法(ML)方法的進化樹繪制，最佳模型(GTR+G+I)，bootstrap值為1000。

2 結果

2.1 搖蚊采集

2016年7月在內蒙古呼和浩特市采集搖蚊41只，其中雌蚊38只(92.68%)、雄蚊3只(7.32%)。

2.2 形態(tài)學鑒定

本研究采集的41只搖蚊標本中，有9只搖蚊頭部較小而扁圓，復眼發(fā)達，兩復眼間有一黑色紐扣樣突起相連(圖1-b)。無單眼。觸角柄節(jié)退化幾乎不可見；梗節(jié)發(fā)達，球狀；鞭節(jié)共5節(jié)，I-IV節(jié)淺黃色泡狀膨隆，V節(jié)深褐色絲狀?？谄魍嘶洗郊跋麓骄珊唵蔚娜赓|葉(圖1-c)。前胸很小，頭后至胸前有一窄條、衣領狀的前胸背板。中胸盾片具有3條品字形排列的黃褐色縱走骨化帶(圖1-c)。中胸小盾片顯著，淺黃色半球形凸起(圖1-c)。小盾片后方的后背片深褐色，有一縱走中縫。中胸腹側板深褐色(圖1-c)。翅透明一色，無鱗片。翅前緣有3條徑脈而互不相接，不形成徑室(圖1-i)。腹部I-V節(jié)深褐色、白色環(huán)形相間，其余腹節(jié)淺黃色(圖1-a)。

有32只搖蚊體色較淺(圖1-d)。頭部較小而扁圓，復眼發(fā)達，兩復眼間距寬(圖1-e)。觸角柄節(jié)退化幾乎不可見；梗節(jié)發(fā)達，球狀；鞭節(jié)共5節(jié)，I-IV節(jié)淺黃色泡狀膨隆，V節(jié)深褐色絲狀(圖1-f)?？谄魍嘶洗郊跋麓骄珊唵蔚娜赓|葉(圖1-e)。前胸很小，頭后至胸前有一窄條、衣領狀的前胸背板。中胸盾片具有3條品字形排列的黃色縱走骨化帶。小盾片顯著，半球形，白色。中胸后背片、中胸腹側板黃色，其余胸部白色(圖1-g)。腹部淺灰及白色(圖1-d)。

a b c

d e f

g h i

2.3 核苷酸同源性分析

對內蒙古采集到的3只形態(tài)學鑒定為搖蚊的標本(均為雌性)進行DNA提取和COI基因PCR擴增，3只標本擴增均為陽性，經序列測定獲得557個核苷酸序列。3只搖蚊COI基因核苷酸同源性為83.5%～100%，其中HS1-1-1和HS1-1-2兩只搖蚊COI基因核苷酸同源性為100%，而與HS1-3-2搖蚊核苷酸同源性僅為83.5%，提示HS1-1-1和HS1-1-2兩只搖蚊為同一種搖蚊，而HS1-3-2為不同搖蚊種類。3只搖蚊COI基因核苷酸與Genebank中8種已知搖蚊相應序列一起進行分析(見表1)，HS1-1-1和HS1-1-2兩只搖蚊與Ch.riparius核苷酸同源性最高為99.8%，與Ch.thummi同源性為99.5%，與其他已知搖蚊同源性均低于90%；HS1-3-2搖蚊與Ch.muratensis核苷酸同源性最高為99.6%，與Ch.annularius和Ch.commutatus同源性分別在97.1%和94.6%，而與其他搖蚊同源性均低于90%。

表1 內蒙古古呼和浩特市搖蚊COI基因核苷酸序列同源性分析 %

2.4 COI基因系統(tǒng)進化分析

采集的3只搖蚊COI基因與GenBank中不同搖蚊種類相應基因序列一起構建系統(tǒng)進化樹，最佳模型選用GTL+G+I模型，見圖2。結果顯示在COI基因構建系統(tǒng)進化樹上采集的3只搖蚊分別位于兩個進化分支內，其中HS1-1-1和HS1-1-2兩只搖蚊與Ch.riparius處于相同化分支內，而HS1-3-2搖蚊與Ch.muratensis處于相同化分支內。以上結果提示HS1-1-1和HS1-1-2兩只搖蚊可能是Ch.riparius，而HS1-3-2搖蚊可能是Ch.muratensis。

遺傳進化樹采用最大似然法(ML)構建，最佳模型(GTR+G+I)；圓點代表本次采集蚊蟲標本 圖2 內蒙古采集搖蚊COI基因(557nt)遺傳進化分析

3 討論

本次研究在內蒙古呼和浩特市周圍農戶家牛棚共采集搖蚊41只，9只搖蚊具有體深褐色，復眼發(fā)達，兩復眼間有一黑色紐扣樣突起相連。觸角鞭節(jié)共5節(jié)，I-IV節(jié)淺黃色泡狀膨隆，V節(jié)深褐色絲狀?？谄魍嘶?，前胸很小，中胸盾片具有3條品字形排列的黃褐色縱走骨化帶。中胸小盾片顯著，淺黃色半球形凸起。小盾片后方的后背片深褐色，有一縱走中縫。中胸腹側板深褐色。翅透明，無鱗片。翅前緣有3條徑脈，而互不相接，不形成徑室。腹部I-V節(jié)深褐色、白色環(huán)形相間，其余腹節(jié)淺黃色等形態(tài)學特征，與Ch.riparius相似的形態(tài)學特征，提示這9只搖蚊為Ch.riparius。

32只搖蚊具有體色較淺，復眼發(fā)達，兩復眼間距寬。觸角鞭節(jié)共5節(jié)，I-IV節(jié)淺黃色泡狀膨隆，V節(jié)深褐色絲狀?？谄魍嘶靶睾苄?，中胸盾片具有3條品字形排列的黃色縱走骨化帶，小盾片顯著，半球形，白色，中胸后背片、中胸腹側板黃色，其余胸部白色，腹部淺灰及白色，與Ch.muratensis相似的形態(tài)學特征，提示這32只搖蚊為Ch.muratensis。進一步采用分子生物學方法在41只搖蚊中挑選3只進行鑒定，結果顯示HS1-1-1和HS1-1-2兩只搖蚊與Ch.riparius處于相同化分支內，它們之間的核苷酸同源性高于98%(蚊蟲種類鑒定標準)[8]；HS1-3-2搖蚊與Ch.muratensis處于相同化分支內，它們之間的核苷酸同源性也高于98%；分子鑒定結果顯示它們分別是Ch.riparius及Ch.muratensis，這與形態(tài)學鑒定結果一致。本研究采用形態(tài)學及分子生物學方法對搖蚊進行了系統(tǒng)的分類鑒定，豐富了我國搖蚊種類資源，為生態(tài)環(huán)境、水體污染的進一步研究提供了科學依據。

搖蚊并不傳播疾病，不是衛(wèi)生害蟲。但因其不同的種類對于水域生態(tài)環(huán)境要求不同，使其成為監(jiān)測水體環(huán)境及污染狀況的指示生物[4]。此外，搖蚊和蠓蟲原先同屬于一個屬，1917年才獨立成科。這兩科昆蟲形態(tài)學特征有很多相似之處[1]，在野外采集時給這兩種昆蟲的鑒定帶來了困難。而蠓蟲能夠傳播藍舌病、鹿流行性出血熱、非洲馬瘟、奧西羅熱等多種人或動物疾病[9]，是醫(yī)學上一種重要的傳播媒介，在現場簡單快速鑒別出搖蚊與蠓科昆蟲，對蟲媒病、人畜共患病及畜牧業(yè)發(fā)展研究具有重要意義。