虹鱒魚(yú)油的酶法提取工藝及其脂肪酸組成分析

趙保堂，牛 源，劉倩霞，劉 東，張 俊，張 繼

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070； 2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

虹鱒魚(yú)為淡水魚(yú)，屬冷水性魚(yú)類，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮爽，富含人體所需的氨基酸和微量元素，并含有化栓去血垢的碳烯酸，適合三高人群食用。在淡水魚(yú)的加工過(guò)程中，可以利用的魚(yú)體僅占40%～50%，而剩余50%～60%的魚(yú)體(魚(yú)頭、魚(yú)尾、魚(yú)內(nèi)臟等)則成為了副產(chǎn)物[1]。絕大多數(shù)虹鱒魚(yú)加工副產(chǎn)物作為飼料或被直接丟棄，造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)與環(huán)境污染[2]。魚(yú)類內(nèi)臟中含有豐富的魚(yú)油，魚(yú)油中富含多不飽和脂肪酸，具有軟化心腦血管、降低患動(dòng)脈粥樣硬化的作用[3-4]。隨著人們認(rèn)識(shí)的不斷深入，魚(yú)油相關(guān)產(chǎn)品越來(lái)越暢銷，并進(jìn)一步促進(jìn)了人們對(duì)于魚(yú)油提取以及精煉方法的研究。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)魚(yú)油的提取分析文獻(xiàn)報(bào)道較多，但是對(duì)于虹鱒魚(yú)油提取分析的研究幾乎沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。對(duì)虹鱒魚(yú)內(nèi)臟中魚(yú)油提取分析，可豐富魚(yú)油的來(lái)源，提高魚(yú)油產(chǎn)量，不但能得到高利用價(jià)值的產(chǎn)品，又能減輕環(huán)境污染[5-6]。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道的魚(yú)油的提取方法有壓榨法、稀堿水解法、索氏提取法和酶法等[5-7]。其中，索氏提取法與稀堿水解法為我國(guó)傳統(tǒng)淡水魚(yú)油提取的主要方法，該法雖然工藝條件比較成熟，但是在提取過(guò)程中產(chǎn)生的廢液、廢渣較多，且提取時(shí)間長(zhǎng)，不能滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[8-11]。課題組成員前期采用超聲波輔助溶劑法對(duì)虹鱒魚(yú)油進(jìn)行提取，結(jié)果表明，超聲波輔助法提取魚(yú)油雖然時(shí)間短、提取效率高，但需要對(duì)魚(yú)油進(jìn)行脫溶劑處理，工藝復(fù)雜[12]。而酶法條件溫和、工藝路線簡(jiǎn)單、無(wú)溶劑殘留，可同時(shí)提取油和蛋白質(zhì)，生產(chǎn)過(guò)程中能耗相對(duì)較低而且適用于工業(yè)化生產(chǎn), 具有廣闊的市場(chǎng)前景。本研究通過(guò)對(duì)虹鱒魚(yú)油的酶法提取工藝研究及其脂肪酸組成分析，旨在獲得最佳的工藝條件，為后續(xù)的研究分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

虹鱒魚(yú)內(nèi)臟：購(gòu)于蘭州市永登縣，去除膽囊及腸道內(nèi)消化物，洗凈瀝干，并用絞肉機(jī)絞碎成糜狀，冷藏備用。

木瓜蛋白酶(BR，800 U/mg)，上海禾午生物科技有限公司；胰蛋白酶(BR，250 U/mg)，上海谷研科技有限公司；胃蛋白酶(BR，3 000 U/mg)，湖南匯百侍生物科技有限公司。無(wú)水乙醇、甲醇、異辛烷，色譜純；石油醚(沸程60～90℃)、乙醚、氫氧化鉀、鹽酸、硫酸氫鈉、硫酸鈉、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FA1104N電子分析天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；磁力攪拌器，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；GC-MS 6800氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 虹鱒魚(yú)內(nèi)臟含油量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取虹鱒魚(yú)內(nèi)臟5.0 g，用濾紙包裹嚴(yán)實(shí)，置于索氏抽提器中，按照索氏提取法加入石油醚(沸程60～90℃)使包裹物完全浸沒(méi)在石油醚中，水浴加熱提取8 h，將提取后的液體用分液漏斗分離水分后，減壓蒸發(fā)揮去石油醚，稱量并計(jì)算虹鱒魚(yú)內(nèi)臟含油量。

1.2.2 虹鱒魚(yú)油的酶法提取

準(zhǔn)確稱取虹鱒內(nèi)臟5.0 g，置于50 mL錐形瓶中，加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，加入酶，在一定溫度下對(duì)其進(jìn)行酶解一定時(shí)間，進(jìn)行滅酶處理，經(jīng)抽濾除去廢渣后，用分液漏斗進(jìn)行油水分離，分離出油層，加入無(wú)水硫酸鈉除去水分，稱魚(yú)油質(zhì)量，根據(jù)下式計(jì)算魚(yú)油提取率。

提取率=提取得到的魚(yú)油質(zhì)量/虹鱒魚(yú)內(nèi)臟含魚(yú)油質(zhì)量×100%

1.2.3 酸價(jià)和過(guò)氧化值的測(cè)定

酸價(jià)參照GB 5009.229—2016測(cè)定，過(guò)氧化值參照GB 5009.227—2016測(cè)定。

1.2.4 脂肪酸組成的測(cè)定

1.2.4.1 脂肪酸甲酯的制備

脂肪酸甲酯參考張靜等[13]的方法制備。

1.2.4.2 分析條件

GC條件：色譜柱為RTX-5MS 型彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量為2.5 μL；程序升溫為柱溫160℃，保留2 min，然后以5℃/min 升至210℃，保留3 min，再以1℃/min升至220℃，保留1 min，最后以5℃/min 升至250℃，保留1 min。

MS條件：離子源為EI源，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有的實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3次重復(fù)，所得數(shù)據(jù)取平均值。采用Design-Expert 8.0及Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶種類對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

稱取 5.0 g虹鱒魚(yú)內(nèi)臟，在液料比4∶1、加酶量2%、酶解時(shí)間60 min條件下，分別采用胃蛋白酶(酶解pH 2.0，酶解溫度37℃)、木瓜蛋白酶(酶解pH 6.0，酶解溫度65℃)、胰蛋白酶(酶解pH 8.0，酶解溫度37℃)提取虹鱒魚(yú)油，研究酶種類對(duì)魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酶種類對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

由圖1可知，采用的酶不同，提取率也有所不同，其中木瓜蛋白酶處理的魚(yú)油提取率最高，達(dá)到了87.15%。不同蛋白酶的水解能力不同，主要是因?yàn)椴煌笇?duì)肽鍵的專一性不同，木瓜蛋白酶的專一性最為廣泛，能很好地水解肽鍵[5]。白鑫華等[14]在提取大鯢魚(yú)油過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶專一性最為廣泛，且很好地水解了肽鍵。因此，選取木瓜蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 不同酶解時(shí)間對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

在酶解溫度60℃、pH 6.5、加酶量2%，液料比4∶1的條件下，研究不同酶解時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

由圖2可知，在酶解60 min內(nèi)魚(yú)油提取率快速增加，在酶解時(shí)間60 min時(shí)提取率達(dá)到82.30%。原因在于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶與底物充分反應(yīng)，破壞了脂肪和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)關(guān)系。隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，魚(yú)油提取率變化不大。王倩倩等[8]在羅非魚(yú)油的提取中，也證明酶與底物的反應(yīng)會(huì)隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而使油脂釋放得更加充分。因此，從能耗和提取率增加量等角度考慮，選取60 min為適宜的酶解時(shí)間。

2.1.3 不同液料比對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

在酶解時(shí)間60 min、酶解溫度60℃、pH 6.5、加酶量2%的條件下，研究不同液料比(1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1)對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，魚(yú)油提取率在液料比為1∶2時(shí)最低，液料比為4∶1時(shí)提取率達(dá)到最大，為85.06%。繼續(xù)增加液料比，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選取4∶1為適宜的液料比。

圖3 液料比對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

2.1.4 不同酶解溫度對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

在酶解時(shí)間60 min、pH 6.5、加酶量2%、液料比4∶1的條件下，研究不同酶解溫度(40、50、60、70、80℃)對(duì)魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

由圖4可知，酶解溫度在40～50℃時(shí)，魚(yú)油提取率顯著增加。隨著酶解溫度的繼續(xù)升高，魚(yú)油提取率趨于上升。當(dāng)酶解溫度高于60℃時(shí)，魚(yú)油提取率趨于下降，表明溫度升高的同時(shí)，酶失活速度也上升。故選擇60℃作為適宜的酶解溫度。

2.1.5 不同加酶量對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

在酶解時(shí)間60 min、酶解溫度60℃、pH 6.5、液料比4∶1的條件下，研究不同加酶量(1%、2%、3%、4%、5%)對(duì)魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 加酶量對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

由圖5可知，隨著加酶量的增多，魚(yú)油提取率顯著上升。加酶量為2%時(shí)，魚(yú)油提取率達(dá)到最高。之后隨著加酶量的繼續(xù)增多，魚(yú)油提取率緩慢降低。故選擇2%為適宜加酶量。

2.1.6 不同pH對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

在酶解時(shí)間60 min、酶解溫度60℃、加酶量2%、液料比4∶1的條件下，研究不同酶解pH(5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)對(duì)魚(yú)油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 pH對(duì)虹鱒魚(yú)油提取率的影響

由圖6可知，酶解pH在5.5～6.5的范圍內(nèi)，隨著pH的升高，魚(yú)油提取率也隨之升高，表明pH升高能促進(jìn)蛋白水解，將油脂釋放出來(lái)。pH為6.5時(shí)，魚(yú)油提取率最高。隨著pH的進(jìn)一步提高，魚(yú)油提取率趨于下降，反映出每種酶都有特定適應(yīng)的pH范圍。因此，選擇pH 6.5為適宜酶解pH。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 回歸方程的建立及模型方差分析

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用木瓜蛋白酶，固定液料比4∶1，以虹鱒魚(yú)油提取率為目標(biāo)函數(shù)Y，以酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、加酶量4個(gè)因素對(duì)應(yīng)變量X1、X2、X3、X4，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶法提取虹鱒魚(yú)油的工藝條件，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件，得到虹鱒魚(yú)油提取率回歸方程的方差分析如表3所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

注：***p<0.000 1,差異極顯著;**p<0.01，差異高度顯著;*p<0.05，差異顯著。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將回歸方程各自應(yīng)變量取一階偏導(dǎo)為0，得到的最佳酶解工藝條件為：酶解時(shí)間61.42 min，酶解溫度61.52℃，pH 7.04，加酶量2.190%。考慮到實(shí)際操作的便利，將酶解參數(shù)修訂為酶解時(shí)間61 min、酶解溫度 61℃、pH 7.0、加酶量 2.2%。對(duì)優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)5次，虹鱒魚(yú)油平均提取率為88.67%。與課題組前期對(duì)虹鱒魚(yú)內(nèi)臟采用超聲波輔助法(超聲功率200 W、超聲時(shí)間58 min、超聲溫度55℃、液料比為12∶1，虹鱒魚(yú)油的最佳提取率為95.10%)相比，在相同的時(shí)間內(nèi)，酶法的提取率較低，主要是因?yàn)樵诿阜ㄌ崛∵^(guò)程中，由于較多虹鱒魚(yú)內(nèi)臟蛋白質(zhì)溶出，導(dǎo)致形成穩(wěn)定的乳狀液，使魚(yú)油提取率降低[12]。酶法提取得到的虹鱒魚(yú)油呈淺黃色、稍有渾濁，具有魚(yú)油腥味、無(wú)酸敗味，酸價(jià)(KOH)和過(guò)氧化值分別為3.68 mg/g和1.75 mmol/kg，符合SC/T 3502—2016粗魚(yú)油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 虹鱒魚(yú)油的脂肪酸組成分析

對(duì)酶法提取的虹鱒魚(yú)油進(jìn)行脂肪酸組成分析，結(jié)果如表4所示。由表4可知，虹鱒魚(yú)油主要由C14～C22脂肪酸組成，其中多不飽和脂肪酸中亞油酸相對(duì)含量最高，為26.75%，其次為亞麻酸，相對(duì)含量為8.93%，DHA相對(duì)含量為4.48%，EPA相對(duì)含量為0.97%。單不飽和脂肪酸油酸的相對(duì)含量為19.99%。與課題組前期對(duì)超聲波輔助法提取的虹鱒魚(yú)油的脂肪酸組成(油酸20.09%，亞油酸26.42%，亞麻酸9.24%，EPA 1.12%，DHA 4.45%)相比，兩者從組成到含量均無(wú)明顯差異，但酶法提取具有無(wú)溶劑殘留、工藝路線簡(jiǎn)單，可同時(shí)提取油和蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)[12]。

表4 虹鱒魚(yú)油主要脂肪酸組成

3 結(jié) 論

本文以虹鱒魚(yú)內(nèi)臟為原料，以虹鱒魚(yú)油提取率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化確定酶法提取虹鱒魚(yú)油的最佳工藝條件為：采用木瓜蛋白酶，液料比4∶1，酶解時(shí)間 61 min，酶解溫度61℃，酶解pH 7.0，加酶量2.2%。在最佳工藝條件下，虹鱒魚(yú)油提取率達(dá)88.67%。提取得到的虹鱒魚(yú)油呈淺黃色、稍有渾濁，具有魚(yú)油腥味、無(wú)酸敗味，酸價(jià)(KOH)和過(guò)氧化值分別為3.68 mg/g和1.75 mmol/kg，符合SC/T 3502—2016粗魚(yú)油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)GC-MS分析顯示，酶法提取的虹鱒魚(yú)油主要不飽和脂肪酸組成為油酸19.99%、亞油酸26.75%、亞麻酸 8.93%、DHA 4.48%、EPA 0.97%。在后續(xù)工作中，將繼續(xù)優(yōu)化酶解條件以提高虹鱒魚(yú)油提取率，同時(shí)回收水相中蛋白質(zhì)，從而推動(dòng)酶法提油在虹鱒魚(yú)油中的工業(yè)化應(yīng)用。