尖葉假龍膽對(duì)脂多糖誘導(dǎo)膿毒癥模型大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用研究*

李 冀 高博文 崔言坤 高彥宇

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

尖葉假龍膽 （Gentianella Acuta）為龍膽科（Gentiananceae）假龍膽屬（Gentianella Moench），味苦、性涼，全草入藥，有清熱利濕之效，而蒙藥名為地格達(dá)，在藏語(yǔ)中亦為苦之意［1-2］。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的主要成分，是引起膿毒癥及與其有關(guān)的急性腎損傷的重要原因［3］。而中醫(yī)學(xué)中并沒(méi)有與膿毒癥急性腎損傷相對(duì)應(yīng)的概念，根據(jù)“高熱”“小便不利”等主要臨床特征，毒（痰、瘀、火熱、濕濁）邪內(nèi)蘊(yùn)為其發(fā)病關(guān)鍵，加之因虛至實(shí)的病機(jī)特點(diǎn)，中醫(yī)治療當(dāng)以益氣清熱解毒［4-5］。本實(shí)驗(yàn)以腹腔注射LPS造模，通過(guò)檢測(cè)大鼠血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及尿中腎組織腎損傷分子-1（KIM-1）、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）水平等，觀察尖葉假龍膽對(duì)大鼠膿毒癥急性腎損傷模型的保護(hù)作用，為臨床治療提供相應(yīng)的理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠32只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào)：SCXK（黑）2017-001。

1.2 試藥與儀器 尖葉假龍膽（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)方劑實(shí)驗(yàn)室提供）；LPS（批號(hào) L2880，Sigma 公司）；Scr、BUN測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；KIM-1、NGAL ELISA試劑盒購(gòu)于上海藍(lán)基有限公司；地塞米松（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma公司）；酶標(biāo)儀（Tecan INFINITE 200 PRO）；紫外分光光度計(jì)（島津 UV2550）；離心機(jī)（Hettich 2205）。

1.3 分組與造模 將32只大鼠隨機(jī)分為尖葉假龍膽組、地塞米松組、模型組與空白組，每組8只。尖葉假龍膽組、地塞米松組與模型組腹腔注射LPS（7 mg/kg）制備大鼠膿毒癥急性腎損傷模型［6］，空白組腹腔注射同體積0.9%氯化鈉注射液，造模后24 h取材。

1.4 干預(yù)方法 尖葉假龍膽由10倍量水浸泡后回流提取2 h，濾渣加10倍量75%乙醇回流提取2 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮成含生藥量1 g/mL的藥液，備用。尖葉假龍膽組大鼠造模前7 d連續(xù)灌胃給藥，給藥量為3 g/（kg·d），同時(shí)間段空白組灌胃給予等量蒸餾水；地塞米松組造模前1 h腹腔注射給藥地塞米松（5 mg/kg）。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）一般情況與尿量：造模后將各組大鼠放入代謝籠中收集尿液，并進(jìn)行一般狀況觀察，計(jì)算 24 h尿量變化。2）血清 Scr、BUN：各組在造模后24 h，1.5%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心（3 000 r/min，5 min，4 ℃）取上清液測(cè) Scr、BUN 水平。 3）尿 KIM-1、NGAL 水平：代謝籠中收集的尿液，離心（1 000 r/min，15 min，4 ℃）收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組均數(shù)采用單因素方差分析，兩兩組間比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 造模前各組大鼠狀態(tài)良好，24 h尿量穩(wěn)定。造模后模型組大鼠呼吸頻率加快，尿少、色深、豎毛、戰(zhàn)栗等癥狀。尖葉假龍膽組與地塞米松組比較癥狀顯著減輕，但對(duì)刺激反應(yīng)較靈敏。

2.2 各組大鼠治療24 h后尿量及血清Scr、BUN水平比較 見表1。24 h時(shí)模型組尿量、血清Scr與BUN與空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；尖葉假龍膽組、地塞米松組尿量變化、血清Scr和BUN與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠治療24 h后尿量、血清Scr、BUN水平比較（x±s）

表1 各組大鼠治療24 h后尿量、血清Scr、BUN水平比較（x±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n BUN（mmol/L）尿量（mL） Scr（μmol/L）空白組 8 4.77±0.69模型組 8 30.50±1.69*地塞米松組 8 17.21±1.29△3.14±0.31 58.05±3.21 8.16±0.44* 85.96±6.35*5.18±0.60△ 70.02±2.85△尖葉假龍膽組 8 25.00±1.98△5.01±0.37△ 74.63±3.89△

2.3 各組大鼠治療24 h后尿液中KIM-1、NGAL水平比較 見表2。24 h時(shí)模型組尿液中KIM-1、NGAL含量與空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；尖葉假龍膽組、地塞米松組尿液中KIM-1、NGAL含量與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

膿毒癥（Sepsis）作為危及生命的器官功能障礙疾病，死亡率極高且病死率在不斷增長(zhǎng)。膿毒癥的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，是引起急性腎損傷（AKI）最主要原因，并發(fā)癥稱為膿毒癥急性腎損傷（SAKI），SAKI約占所有病因引起AKI的50%，且30%～50%的膿毒癥患者發(fā)生AKI［7-10］。前期研究表明LPS能夠?qū)е履摱景Y性急性腎損傷［11］，LPS誘導(dǎo)的動(dòng)物模型具有易復(fù)制、較高的血清細(xì)胞因子等優(yōu)勢(shì)，其中腹腔注射比靜脈注射更易復(fù)制高動(dòng)力循環(huán)的特點(diǎn)［12］。血清中的Scr和BUN主要反映了腎小球的濾過(guò)功能，故常作為檢測(cè)腎功能的生化指標(biāo)［13-14］，實(shí)驗(yàn)中較之模型組，尖葉假龍膽尖葉假龍膽組降低了血清中Scr、BUN的水平，一定程度上反映了其對(duì)該模型的保護(hù)作用。KIM-1是一種跨膜糖蛋白，在正常肝、腎、脾中微量表達(dá)，而在受損后再生的近曲小管上皮細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)，并呈時(shí)間依賴性。其細(xì)胞外域可裂解為可融性片段釋放入細(xì)胞外，并最終排入尿中，參與免疫耐受反應(yīng)過(guò)程，影響了T細(xì)胞分化及巨噬細(xì)胞的活化［15］，故具有良好的特異性與敏感性［16-18］。NGAL則作為一種損傷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)鐵蛋白，通過(guò)改善細(xì)胞內(nèi)輔酶鐵的代謝來(lái)調(diào)節(jié)多種參與細(xì)胞生命重要蛋白質(zhì)的合成，在腎臟損傷（上皮細(xì)胞受損）時(shí)上調(diào)并釋放，故尿液NGAL是AKI早期損傷的敏感標(biāo)志物［19-20］。近年常把KIM-1與NGAL作為急性腎小管損傷的兩種標(biāo)志，同時(shí)作為該研究的檢測(cè)指標(biāo)。尖葉假龍膽組顯著降低了尿中KIM-1與NGAL水平。而地塞米松作為經(jīng)典傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素類藥物，具有很好的抗炎和免疫抑制作用，因其生理劑量及應(yīng)激劑量可以上調(diào)腎組織中表達(dá)，減輕膿毒癥引起的腎組織損傷，作用明顯優(yōu)于大劑量［21］，因此選其作為陽(yáng)性藥對(duì)照組。綜上所述，我們的研究表明，尖葉假龍膽對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷模型起到一定的保護(hù)作用，可能與抑制KIM-1與NGAL蛋白有關(guān)，相關(guān)通路及機(jī)制將作為下一階段的研究方向。

表2 各組大鼠治療24 h后尿液中KIM-1、NGAL水平比較（ng/mL，x±s）

表2 各組大鼠治療24 h后尿液中KIM-1、NGAL水平比較（ng/mL，x±s）

組 別 n KIM-1 NGAL空白組 8模型組 8地塞米松組 8 1.57±0.18 2.45±0.15 16.04±0.29* 14.50±0.29*9.31±0.48△ 6.98±0.27△尖葉假龍膽組 813.23±0.33△ 7.26±0.22△