針刺對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠JAK2、P-STAT3、IL-17表達(dá)的影響

李 琪，趙東杰，王玉華，董 莎，常 磊，張 鵬，宋方亞，辛隨成

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為主要病理特征的自身免疫性疾病，好發(fā)于中青年，男女比例約為1∶2，最常累及腦室周圍白質(zhì)、視神經(jīng)、脊髓及腦干等部位，常見癥狀有肢體癱瘓、視力障礙、共濟(jì)失調(diào)、言語困難及感覺異常等，且易反復(fù)發(fā)作，遺留神經(jīng)系統(tǒng)癥狀或體征，最終造成神經(jīng)功能不可逆缺損，嚴(yán)重影響工作與生活。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是目前國際上研究MS的經(jīng)典動物模型[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在MS/EAE中被激活的免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子(如IL-17)進(jìn)入血-腦脊液屏障，促進(jìn)疾病發(fā)展[2]。JAK/STAT信號通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的生物學(xué)活性，是主要介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)通路，為調(diào)控免疫應(yīng)答所必需[3-4]。

目前,西醫(yī)無特異性的有效治療手段，國內(nèi)外的一線治療方案均采取激素治療，但其療效和預(yù)后較差，且不良反應(yīng)明顯(肥胖，電解質(zhì)紊亂，血糖、血壓、血脂異常，上消化道出血，骨質(zhì)疏松及股骨頭壞死等)、價格昂貴，不適合長期服用[5]。針刺作為一種非藥物醫(yī)療手段在疾病治療中被頻繁提及，MS患者的針刺使用率有7.2%～21%不等，不少報道顯示，針刺能改善MS殘疾程度、控制復(fù)發(fā)及對癥治療[6-8]。

本研究通過測定C57BL/6小鼠EAE的體質(zhì)量、神經(jīng)功能缺損評分、腦組織JAK2、P-STAT3表達(dá)及血清IL-17表達(dá)，探討針刺干預(yù)C57BL/6小鼠EAE的療效及其對JAK2/STAT3信號通路的調(diào)節(jié)作用，為臨床治療MS提供新的思路及理論支持。

1 材料

1.1 實驗動物和分組

40只SPF級雌性8～10周齡的C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司，體質(zhì)量18～20 g，動物批號：SCXK(京)20160006。實驗動物分組：將40只實驗動物稱重編號后，按隨機(jī)數(shù)字表分成空白對照組、EAE模型組、激素治療組、針刺治療組，每組10只。經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動物實驗中心屏障環(huán)境動物實驗室，室溫20～24℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗周期。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實驗。

1.2 主要儀器和試劑

髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55，MOG35-55，純度：98.55%，購自北京百諾威生物有限公司，批號：NJP30376-180111)；百日咳毒素 (Pertussis toxin，PTX，購自北京百諾威生物有限公司，批號：181236A1)；完全弗氏佐劑(CFA，其中結(jié)核桿菌H37Ra終濃度為4 mg/mL，購自北京華菁科技有限公司，批號：170597)；JAK2抗體(產(chǎn)自abcam公司，批號：ab39636)；P-STAT3抗體(產(chǎn)自abcam公司，批號：ab76315)；小鼠IL-17A/F酶聯(lián)試劑盒(產(chǎn)自聯(lián)科生物，批號：EK21772)；醋酸潑尼松片(5 mg/片，產(chǎn)自上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：017171002)；針刺用具(中研太和牌無菌針刺針，規(guī)格:0.25 mm×25 mm)。

2 方法

2.1 動物模型制備

EAE模型建立：將抗原MOG35-55用生理鹽水稀釋成10 mg/mL，并按1∶1等體積加入完全弗氏佐劑(其中結(jié)核桿菌H37Ra終濃度為4 mg/mL)混合制作乳化劑。乳化后以每只0.1 mL于小鼠脊柱兩側(cè)分4點進(jìn)行皮下注射，免疫當(dāng)天(即第0 h)及第2天(即48 h)分兩次腹腔注射0.5 mL PTX(500 ng/只)，建立小鼠EAE模型。上述免疫過程在乙醚麻醉及充分固定下進(jìn)行。模型鑒定：從免疫第0天開始直到免疫第28天實驗結(jié)束取材為止，每天在相同的時間點(下午14:00—16:00)觀察小鼠的行為學(xué)變化(如毛色、行為及飲食)，隔天稱量記錄小鼠的體重，記錄神經(jīng)功能評分，標(biāo)準(zhǔn)參考國際通用5分評分制[9]：0分：無癥狀；1分：尾張力消失，輕度步態(tài)笨拙；2分：一側(cè)后肢無力，被動翻身后恢復(fù)；3分：雙后肢癱瘓，刺激后可挪動；4分：雙后肢癱瘓伴有前肢癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡。其中，癥狀在兩者之間者，以±0.5分計算。

2.2 干預(yù)方法

針刺治療組免疫后第14天開始，每天同一時間(上午9:00)進(jìn)行針刺治療，每次留針15 min，至第28天取材，共15次。針刺方法：在不麻醉的情況下，將實驗小鼠固定于自制束鼠器上，常規(guī)消毒，選用規(guī)格為0.25 mm×25 mm毫針針刺小鼠“大椎穴”(第7頸椎與第1胸椎之間，背部正中，直刺2～3 mm)、雙側(cè)“腎俞穴”(第2腰椎下兩旁，向脊柱方向斜刺2～3 mm)、雙側(cè)“足三里”(膝關(guān)節(jié)下外側(cè)，腓骨小頭下3.5 mm處直刺2～3 mm)。每次均為同一人針刺，準(zhǔn)確取穴，嚴(yán)格按照要求深度針刺。激素治療組免疫后第14天開始，每天同一時間(上午9:00)，對小鼠進(jìn)行激素沖擊療法，每次醋酸潑尼松混懸液(0.6 mg/mL，醋酸潑尼松片用生理鹽水配制成要求的濃度)灌胃，0.1 mL/10 g/天，連續(xù)治療15天?？瞻讓φ战M和EAE模型組每天抓取1次。

2.3 檢測方法

腦病理組織學(xué)檢查：實驗小鼠于免疫后第28天，用水合氯醛麻醉至小鼠軟癱，然后剪開胸腔，充分暴露心臟，用注射針頭快速左心室內(nèi)插管，用動脈夾將針頭固定好，剪開右心耳，以0.9%生理鹽水沖洗，待肝臟變白再用4%多聚甲醛緩沖液灌注固定，進(jìn)行心臟灌流，斷頭取全腦浸于4℃的4%多聚甲醛中固定24 h，從大腦冠狀位由視交叉向尾端取3～4 mm組織塊，石蠟包埋。石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，制備成5 μm的切片，進(jìn)行LFB髓鞘染色。

檢測腦組織中JAK2、P-STAT3免疫組化表達(dá)：取以上切片作JAK2、P-STAT3免疫組化染色，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，陽性表達(dá)為細(xì)胞染成黃色或棕黃色。每只小鼠隨機(jī)選擇1張切片，并在顯微鏡下選擇側(cè)腦室周圍的3個隨機(jī)視野(HP，400×)，采用Image-proplus 6.0軟件，分別計算各個部位的陽性表達(dá)的積分光密度值(IOD/HP)。

檢測血清ELISA的IL-17表達(dá)：取小鼠各組凍存血清，通過ELISA雙抗體夾心法檢測細(xì)胞因子IL-17水平，具體操作按照聯(lián)科生物公司ELISA試劑盒所提供的實驗步驟進(jìn)行，在酶標(biāo)儀(ELx800，BioTek)讀取數(shù)據(jù)。

2.4 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠體質(zhì)量和神經(jīng)功能學(xué)評分比較

圖1 各組小鼠免疫第0天至28天體質(zhì)量變化

圖2 各組小鼠免疫第0天至28天神經(jīng)功能缺損評分

免疫后的小鼠發(fā)病率為100%(30/30)。小鼠免疫后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、食欲下降、體重減輕，于免疫10天逐漸出現(xiàn)臨床癥狀，如尾部無力、肢體癱瘓、二便失禁和偶有背部皮膚破潰等，逐漸加重，空白對照組無小鼠發(fā)病，體重持續(xù)增長，活動度正常，各組小鼠體質(zhì)量、神經(jīng)功能評分和狀態(tài)見圖1～3。免疫0天，各組小鼠體質(zhì)量和神經(jīng)功能缺損評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。免疫14天，與空白對照組相比，EAE模型組、激素治療組和針刺治療組的小鼠體重均持續(xù)下降(P<0.01),神經(jīng)功能缺損評分均顯著增加(P<0.01)。免疫20天，與EAE模型組相比，激素治療組、針刺治療組的小鼠體質(zhì)量均升高(P<0.01)、神經(jīng)功能缺損評分均顯著降低(P<0.01)；與激素治療組相比，針刺治療組的小鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.01)。免疫28天，與EAE模型組相比，激素治療組、針刺治療組的小鼠體質(zhì)量均升高(P<0.01),神經(jīng)功能缺損評分均降低(P<0.05)；兩治療組相比，針刺治療組小鼠的體質(zhì)量較低(P<0.05),神經(jīng)功能缺損評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1～2。

小鼠狀態(tài)觀察示空白對照組小鼠的神經(jīng)功能無異常，評分為0分;EAE模型組小鼠的雙后肢癱瘓，刺激后可挪動，神經(jīng)功能異常，評分為3分；激素治療組小鼠的尾部張力消失，步態(tài)不穩(wěn)，神經(jīng)功能異常，評分為1分；針刺治療組小鼠的一側(cè)后肢無力，步態(tài)蹣跚，神經(jīng)功能異常，評分為2分。見封三彩圖3。

表1 各組小鼠體質(zhì)量情況比較

注：與空白對照組比較，★★P<0.01；與EAE模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與激素治療組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01。

表2 各組小鼠神經(jīng)功能評分情況比較

注：與空白對照組比較，★★P<0.01；與EAE模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與激素治療組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01。

3.2 各組小鼠腦組織病學(xué)檢查結(jié)果比較

空白對照組小鼠的腦組織無異常,未見脫髓鞘。EAE模型組、激素治療組和針刺治療組小鼠的腦組織可見大小不等的片狀髓鞘脫失區(qū)，呈空泡樣改變，以側(cè)腦室周圍最明顯。其中EAE模型組髓鞘脫失最明顯，有大量空泡樣改變；激素治療組、針刺治療組較EAE模型組髓鞘脫失程度有所減輕，有少量空泡樣改變。見封三彩圖4。

3.3 各組小鼠腦組織JAK2、P-STAT3免疫組化表達(dá)

與空白對照組相比，EAE模型組、激素治療組和針刺治療組的小鼠腦組織JAK2、P-STAT3的表達(dá)水平有顯著差異(P<0.01)；與EAE模型組相比，激素治療組和針刺治療組的小鼠腦組織JAK2、P-STAT3的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；針刺治療組與激素治療組相比，小鼠腦組織中JAK2、P-STAT3的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腦組織中免疫組化JAK2、P-STAT3平均積分光密度IOD值

注：與空白對照組比較，★★P<0.01；與EAE模型組比較，△△P<0.01。

腦組織JAK2免疫組化陽性表達(dá)為細(xì)胞呈黃色?？瞻讓φ战MJAK2陽性細(xì)胞著色淺，呈淡黃色，數(shù)量少；EAE模型組著色深，呈褐黃色，數(shù)量多；激素治療組著色較深，呈棕黃色，數(shù)量較少，介于EAE模型組和空白對照組之間；針刺治療組著色較深，呈棕黃色，數(shù)量較少，介于EAE模型組和空白對照組之間。見封三彩圖5。

腦組織P-STAT3免疫組化陽性表達(dá)為細(xì)胞呈黃色?？瞻讓φ战MP-STAT3陽性細(xì)胞著色淺，呈淡黃色，數(shù)量少；EAE模型組著色深，呈棕黃色，數(shù)量多；激素治療組著色較深，呈黃色，數(shù)量較少，介于EAE模型組和空白對照組之間；針刺治療組著色較深，呈黃色，數(shù)量較少，介于EAE模型組和空白對照組之間。見封三彩圖6。

3.4 各組小鼠血清ELISA的IL-17表達(dá)比較

與空白對照組相比，EAE模型組、激素治療組和針刺治療組的小鼠血清ELISA的IL-17表達(dá)水平有顯著差異(P<0.01)；與EAE模型組相比，激素治療組、針刺治療組的小鼠血清ELISA的IL-17表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；針刺治療組和激素治療組相比，小鼠血清ELISA的IL-17表達(dá)水平有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠血清中IL-17含量

注：與空白對照組比較，★★P<0.01；與EAE模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與激素治療組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01。

4 討論

MS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為主要病理特征的自身免疫性疾病，研究表明髓鞘脫失與淋巴細(xì)胞(CD4+)介導(dǎo)的細(xì)胞免疫有關(guān)[10]。在細(xì)胞因子TGF-β和IL-6的共同誘導(dǎo)下，初始CD4+T淋巴細(xì)胞在JAK2/STAT3調(diào)控下，可分化為Th17細(xì)胞，并與IL-17基因結(jié)合，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步分泌致炎因子IL-17，誘導(dǎo)嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤、髓鞘脫失、軸索損傷或膠質(zhì)細(xì)胞增生，能導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞不可逆的變性死亡[11-12]。JAK/STAT是一條涉及多種細(xì)胞因子和生長因子的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，受多種細(xì)胞因子激活，具有信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化相應(yīng)靶基因的雙重作用，對維持機(jī)體正常狀態(tài)、改善神經(jīng)退行性變有重要作用[13]。JAK是STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游激酶，被激活的JAK可誘導(dǎo)細(xì)胞胞漿中STAT單體分子磷酸化(P-STAT)形成STAT二聚體，然后向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移并調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)[14]。研究表明，在MS/EAE中，JAK/STAT信號通路失調(diào)可導(dǎo)致自身免疫性疾病，其中STAT1和STAT3是MS患者的易感基因[3-4]。以MOG35-55多肽加CFA作為抗原，PTX增強(qiáng)抗原，免疫C57BL/6小鼠制備MS的EAE動物模型，所建模型穩(wěn)定，發(fā)病率可高達(dá)100%。

中醫(yī)無“多發(fā)性硬化”病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)常將其歸屬于“痿癥”范疇，以腎虛為主[15]?！端貑枴ゐ粽撈吩?“有所遠(yuǎn)行勞倦，逢大熱而渴，渴則陽氣內(nèi)伐，內(nèi)伐則熱舍于腎，腎者水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”,腎主骨生髓，腎衰則形體疲極。這與MS患者最常見的肢體遲緩無力、萎縮廢用等臨床表現(xiàn)十分切合。背俞穴屬于足太陽膀胱經(jīng)，是五臟六腑之氣輸注之處，臟腑氣機(jī)條達(dá)則氣血運(yùn)行正常，無痿痹之患。故針刺腎俞穴能補(bǔ)腎氣、益陰陽、強(qiáng)腰健骨、補(bǔ)先天之本。《難經(jīng)·二十八難》曰:“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬腦”。督脈“總督諸陽”，是“陽脈之?！保€絡(luò)一身之陰氣，五臟六腑之氣的輸注、功能活動與督脈密切相關(guān)。故針刺大椎穴，通調(diào)督脈，統(tǒng)理十二經(jīng)脈之陽氣，使上下貫通，陽氣通達(dá)，加強(qiáng)腦、脊髓和腎的密切關(guān)系，是臨床常用穴位。《素問·痿論篇》曰:“陽明者,五臟六腑之海,主潤宗筋,宗筋主束骨而利機(jī)關(guān)也……故陽明虛,則宗筋縱,帶脈不引,故足痿不用也”。陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng),“治痿獨(dú)取陽明”，故針刺陽明經(jīng)穴足三里,氣血生化有源,經(jīng)脈得養(yǎng),關(guān)節(jié)得利而活動自如。

針刺作為疾病治療中一種重要的非藥物醫(yī)療手段，目前有7.2%～21%的MS患者應(yīng)用，而且不少臨床報道顯示，針刺能改善MS殘疾程度、控制疾病復(fù)發(fā)及對癥治療(痛性痙攣、慢性疼痛、感覺異常、抑郁焦慮、乏力、疲勞、震顫、膀胱直腸功能障礙及性功能障礙、認(rèn)知障礙等)[6-8]。筆者團(tuán)隊具有針刺干預(yù)EAE的前期動物實驗基礎(chǔ)，且導(dǎo)師有30多年針刺治療MS的臨床經(jīng)驗，療效可觀。MS屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，研究發(fā)現(xiàn)，針刺可有效調(diào)節(jié)內(nèi)分泌激素、細(xì)胞因子等多個環(huán)節(jié)促進(jìn)MS患者細(xì)胞免疫與體液免疫系統(tǒng)恢復(fù)功能及維持平衡。針刺穴位后，局部神經(jīng)和相應(yīng)感受器可將刺激信號傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起中樞釋放遞質(zhì)、分泌細(xì)胞因子等免疫反應(yīng)，可實現(xiàn)人體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能[16]。在MS/EAE中，實驗研究表明，通過JAK2/STAT3調(diào)控，CD4+T淋巴細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，分泌致炎因子IL-17，針刺能夠降低EAE炎性細(xì)胞浸潤，下調(diào)CD4+T細(xì)胞表達(dá)，改善神經(jīng)功能評分[17-18]，降低Th17細(xì)胞的表達(dá)[19-21]，減輕其腦組織的病理改變，有效地抑制小鼠促炎性細(xì)胞因子IL-17的分泌[22]。針刺調(diào)節(jié)JAK/STAT通路的研究主要集中于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腦缺血和膝骨關(guān)節(jié)炎等免疫炎性疾病，均提示針刺可調(diào)節(jié)JAK/STAT通路，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，針刺能改善腦缺血后神經(jīng)功能缺損評分，下調(diào)JAK2 mRNA的表達(dá)，提示針刺能阻斷JAK2在JAK/STAT途徑中誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活[23-25]。然而，針刺是否對EAE小鼠JAK2/STAT3信號通路有調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，EAE模型組小鼠體質(zhì)量降低、神經(jīng)功能缺損評分顯著升高、腦組織病理脫髓鞘明顯、腦組織JAK2、P-STAT3表達(dá)顯著升高，血清IL-17表達(dá)顯著增加，提示EAE小鼠JAK2/STAT3信號通路可能被過度活化而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎性反應(yīng)。與EAE模型組比較，經(jīng)針刺或者激素治療后，神經(jīng)功能缺損評分，腦組織病理脫髓鞘程度，腦組織JAK2、P-STAT3表達(dá)，血清IL-17表達(dá)均顯著降低，提示針刺和激素治療對EAE小鼠均有治療作用，能改善神經(jīng)功能、病理脫髓鞘程度，降低JAK2、P-STAT3及IL-17表達(dá)，抑制免疫炎性反應(yīng)。與激素治療組相比，針刺治療組小鼠體質(zhì)量較低，神經(jīng)功能缺損評分較高，病理脫髓鞘程度較重，JAK2、P-STAT3和IL-17表達(dá)較高，針刺治療對EAE小鼠療效顯著，但療效未及激素治療，可作為一種輔助治療，對MS的治療具有潛在的價值。

綜上所述，針刺“大椎穴”“腎俞穴”“足三里”可能是一種治療MS安全、有效、簡便、經(jīng)濟(jì)的療法，其治療機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路的表達(dá)、降低IL-17表達(dá)、改善神經(jīng)炎癥和脫髓鞘程度有關(guān)。其具體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不確定，更多深入、全面的機(jī)制探索需在今后的研究中進(jìn)一步探討。