miR-182抑制HES激活Notch信號(hào)協(xié)調(diào)TGF-β信號(hào)途徑促進(jìn)急性川崎病

呂典一 武付霞 陳鳳儀

川崎病(kawasaki disease，KD)又稱皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征(mucocutaneous lymph node syndrome，MCLS)，是兒科常見的一種以全身性血管炎為主要病理改變的急性發(fā)熱性出疹性疾病。相關(guān)研究表明，KD的發(fā)生與急性免疫功能失衡有關(guān)[1]。Treg細(xì)胞屬于T細(xì)胞亞群，外周血叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein3，F(xiàn)oxp3)是其主要標(biāo)志物之一。而Jagged1介導(dǎo)的Notch激活可以抑制人類靜脈內(nèi)皮的增生。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)通過(guò)誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)，促進(jìn)活化的CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，而TGF-β與白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)共同作用可以抑制Treg細(xì)胞產(chǎn)生，并誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞[2]。TGF-β信號(hào)途徑與Notch信號(hào)途徑間存在對(duì)話通路，可以在多種細(xì)胞中協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)。相關(guān)研究表明，Notch信號(hào)途徑可以上調(diào)Foxp3蛋白的表達(dá)[3]。

研究表明miR-23a 、miR-130a和miR-125b在川崎病患者外周血清中均有表達(dá)[4-5]，通過(guò)對(duì)川崎病人血液樣本外泌體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-1246、miR-4436、miR-197、miR-671表達(dá)明顯上調(diào)。通過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn)miR-182在川崎病急性發(fā)病期顯著上調(diào)，結(jié)合目前國(guó)際上相關(guān)川崎病的miRNA靶標(biāo)研究，本研究對(duì)miR-182在急性川崎病發(fā)生及與川崎病患者臨床特征的研究進(jìn)行探討，旨在為急性川崎病檢測(cè)與治療提供新靶點(diǎn)。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

選取2016年7月至2018年6月本院收治的急性期KD患兒(發(fā)熱5～6天)21例為KD急性組，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015年第七版實(shí)用兒科學(xué)[11]其中男12例，女9例；平均年齡(23.2±18.4)歲。選取同期于本院治療的治愈期KD患兒14例KD治愈組，平均年齡(20.9±19.1)歲，男8例，女6例；同時(shí)選取健康兒童16例為正常對(duì)照組，平均年齡(22.3±10.1)歲,男11例，女5例。三組對(duì)象的年齡、性別等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)腎病綜合征、先天性免疫缺陷病，過(guò)敏性疾病等免疫系統(tǒng)疾??；(2)近6個(gè)月未使用影響免疫功能的藥物。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患兒監(jiān)護(hù)人知情同意并簽署知情同意書。

二、方法

1.血樣采集：采用肝素鈉抗凝采血管收集患兒入院時(shí)急性期、治愈期及正常對(duì)照組兒童清晨空腹靜脈血3ml。KD急性組患兒于靜脈注射丙種球蛋白前l(fā)天抽血。

2.流式細(xì)胞法檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞比例：取兩個(gè)流式細(xì)胞檢測(cè)管，分別標(biāo)記為Treg細(xì)胞管和陰性對(duì)照管。兩管分別加入100 μl血、20 μl CD4-FITC和20 μl CD25-PC5，劇烈蝸旋，室溫下避光孵育15 min。于Treg細(xì)胞管中加入100 μl破膜劑I，劇烈蝸旋，室溫下避光孵育15 min；陰性對(duì)照管中加入磷酸鹽緩沖液(PBS) 2 ml，20 ℃ 300g離心5 min，棄上清。Treg細(xì)胞管中加破膜劑II 100 μl，室溫下孵育5 min，輕輕振蕩1～2 s；兩管分別加試劑20 μl Foxp3-PE、Mouse IgG1-PE，輕輕振蕩，室溫避光孵育15 min，兩管均加PBS 2 ml，20 ℃300g離心5 min，棄上清，加500 μl PBS，4 ℃冰箱保存，24 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

3.qRT-PCR檢測(cè)：取KD急性組、KD治愈組和正常對(duì)照組血清標(biāo)本各0.5 ml，采用TRIzol法提取血清總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取到的總RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格參照Trizol試劑盒說(shuō)明書。采用qRT-PCR法檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)水平，具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)Treg細(xì)胞，待細(xì)胞融合度≥80%時(shí)，用2.5%的胰蛋白酶每2天進(jìn)行消化，傳代，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Treg細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔接種1.5×106個(gè)，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將Treg細(xì)胞分為2組：Ncontrol的miRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染組以及miR-182過(guò)表達(dá)miRNA轉(zhuǎn)染組，并將培養(yǎng)基換成每孔1 ml無(wú)血清無(wú)雙抗的培養(yǎng)基，miRNA及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000分別用100 μl OMEM稀釋后，依照公司說(shuō)明書所需比例混勻后靜置20 min后，逐滴加入并且輕晃混勻，培養(yǎng)6 h后，再換為含完全培養(yǎng)基，待48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行下一步分析。

6.熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)：通過(guò)microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-182與HES1的3’-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。為了驗(yàn)證miR-182與HES1是否存在靶向關(guān)系，構(gòu)建野生型HES1的3’-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-HES1-wt，并以pMIR-HES1-wt質(zhì)粒為模板，利用PCR搭橋法(overlapping PCR)構(gòu)建其潛在結(jié)合位點(diǎn)突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-HES1-Mut。將miR-182 mimics，negative control miRNA mimics (miR-NC)，內(nèi)參海腎熒光素酶以及pMIR-HES1-wt和pMIR-HES1-Mut報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)HCAEC細(xì)胞中，于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后收取細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定三組細(xì)胞的熒光素酶活性。具體操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

7. Western Blot：采用含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS和蛋白酶抑制劑及1 mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液分離蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，按說(shuō)明書進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。

結(jié) 果

一、KD患兒的臨床資料及miR-182在KD臨床特征的相關(guān)性

我們通過(guò)血液常規(guī)檢測(cè)KD各組的臨床研究數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，除各組研究對(duì)象年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其他各組數(shù)據(jù)相比都具有顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)對(duì)象分組是有可比性的，有研究?jī)r(jià)值(表1)。我們進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)血清miR-182表達(dá)水平與KD患兒臨床特征的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-182在血小板計(jì)數(shù)大于300×109/L的KD急性組血清中的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，而其他各組數(shù)據(jù)指標(biāo)上并無(wú)顯著性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。結(jié)果提示，急性KD血清中miR-182表達(dá)量相對(duì)較高，這種異?，F(xiàn)象可能是參與KD病理進(jìn)程，miR-182對(duì)急性KD具有調(diào)控功能。

表1 血液檢測(cè)KD各組的臨床數(shù)據(jù)

表2 檢測(cè)血清miR-182表達(dá)水平與KD臨床特征相關(guān)性

二、流式細(xì)胞法檢測(cè)各組外周血中Treg細(xì)胞比例

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：KD急性組外周血中Treg細(xì)胞比例為(4.4±1.4)%，明顯低于KD治愈組和正常對(duì)照組的(9.0±2.0)%、(10.2±2.8)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)表3。

三、外周血中目的基因qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

1.外周血mRNA表達(dá)水平的比較:qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：KD急性組中( Foxp3, Notch1,Notch3,Jagged1,HES1) mRNA 的表達(dá)水平低于KD治愈組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而KD急性組中Jagged2 mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照和KD治愈組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)表4。

GroupnTreg cell fraction(%)Acute214.4±1.4Cure149.0±2.0Normal control1610.2±2.8

表4 外周血中外周血中mRNA 表達(dá)水平的比較

2.TGF-βmRNA表達(dá)水平的比較:qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：KD治愈組與正常對(duì)照組外周血中TGF-β mRNA表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；KD急性組外周血中TGF-β mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組和KD治愈組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

3. TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)水平的比較:qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：KD急性組TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá)水平均明顯低于正常對(duì)照組與KD治愈組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

四、 miR-182與靶基因HES1的關(guān)系

雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-182 mimics可以抑制pMIR-HES1-wt質(zhì)粒熒光素酶活性；而對(duì)pMIR-HES1-Mut熒光素酶活性無(wú)明顯影響(圖3)。

五、miR-182與靶基因HES1的調(diào)控作用

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-182對(duì)HES1的調(diào)控作用，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-182 mimics轉(zhuǎn)染組中HES1 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：miR-182 mimics轉(zhuǎn)染組中HES1蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明miR-182能夠抑制HES1的mRNA翻譯及其蛋白表達(dá)(圖4)。

Note: **compared with the normal control group(NC), P<0.01圖1 各組外周血中TGF-β mRNA的表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of TGF- mRNA in peripheral blood by KD group

Note: **compared with the normal control group(NC), P<0.01圖2 各組外周血中TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá)水平Figure 2 Expression levels of TGF- RI mRNA, TGF- RII mRNA, Smad3 mRNA and Smad4 mRNAby groupThe expression levels of A.TGF- RI mRNA, B.TGF-RIImRNA, C.Smad3mRNA,D. Smad4 mRNA were detected by qRT-PCR** compared with the normal control group, P<0.01

Note: B ** compared with the normal control group, P<0.01圖3 miR-182與靶基因HES1的相關(guān)性Figure 3 The correlation between miR-182 and the target gene HES11.the binding site of mir-182 to the target gene，B.luciferase activity was detected by luciferase reporter gene assay ** compared with the normal control group, P<0.01

圖4 miR-182與靶基因HES1 mRNA表達(dá)水平及蛋白含量的關(guān)系Figure 4 Expression and protein content of miR-182 and the target gene HES1 mRNAA.the expression level of HES1 mRNA in miR-182 was detected by qRT-PCR,B.the protein expression level of HES1was detected by Western blot

六、HES1激活Notch及TGF-β信號(hào)通路

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示在HES1處理組中Notch及TGF-β途徑受體Notch1、Notch3、TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4的磷酸化蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在加入抑制劑后，在DAPT+HES1處理組中則顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示HES1激活了Notch及TGF-β信號(hào)通路，誘導(dǎo)了途徑受體表達(dá)升高。

圖5 HES1激活Notch及TGF-β信號(hào)通路Figure 5 HES1 activated Notch and TGF- signaling pathways

討 論

川崎病是兒童常見的一種自身免疫性血管炎綜合征，其主要累及患兒心臟的冠狀動(dòng)脈，可導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、冠狀動(dòng)脈狹窄及冠狀動(dòng)脈瘤，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患兒心肌梗死。目前，KD已成為兒童成年后心臟疾病和冠狀動(dòng)脈損傷的重要原因之一。

Treg細(xì)胞是維持機(jī)體自身耐受，負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素。Foxp3主要表達(dá)于Treg細(xì)胞，是Treg細(xì)胞的主要標(biāo)志物，也是Treg細(xì)胞發(fā)育、功能特異性的主要調(diào)節(jié)因素之一。本研究結(jié)果顯示，KD急性組外周血中Treg細(xì)胞比例、Foxp3 mRNA表達(dá)水平均低于正常對(duì)照組和KD治愈組。急性KD患兒外周血中Treg細(xì)胞減少，與KD的病理進(jìn)程有關(guān)系，而Foxp3的低表達(dá)可能是Treg細(xì)胞減少的重要原因，可能在急性川崎病的病理進(jìn)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[6]。

相關(guān)研究表明，TGF-β單獨(dú)存在時(shí)可以上調(diào)初始T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)，促進(jìn)初始T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞[7]。本研究結(jié)果顯示，KD急性組TGF-β mRNA的表達(dá)水平低于正常對(duì)照組和KD治愈組。結(jié)果提示，TGF-β的低表達(dá)可能與Foxp3異常表達(dá)有關(guān)，是導(dǎo)致Treg細(xì)胞減少的重要原因。TGF-β與其受體Ⅱ結(jié)合形成雜合四聚體復(fù)合物，激活TGF-β信號(hào)通路。TGF-β Ⅱ型受體激活時(shí)，可使TGF-β Ⅰ型受體富含甘氨酸、絲氨酸的區(qū)域磷酸化，進(jìn)而磷酸化Smad3蛋白。Smad3磷酸化后與受體/SARA復(fù)合物脫離，與Smad4形成低聚復(fù)合物。低聚復(fù)合物可以易位至細(xì)胞核，與Foxp3啟動(dòng)子富含GC序列的區(qū)域相互作用，誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，KD急性組TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá)水平均低于正常對(duì)照組與KD治愈組(P<0.05)，表明Smad蛋白信號(hào)途徑的低表達(dá)可能是急性KD Foxp3表達(dá)水平下降的直接原因。

相關(guān)研究表明，TGF-β和Notch信號(hào)途徑間存在對(duì)話通路，Notch信號(hào)途徑與Treg細(xì)胞分化有關(guān)，Notch1是TGF-β1介導(dǎo)Treg細(xì)胞免疫抑制的關(guān)鍵因子[8]。HES1可能是Notch和TGF-β信號(hào)途徑的直接靶基因，TGF-β信號(hào)途徑中釋放的磷酸化Smad3蛋白與Notch信號(hào)途徑中釋放的Notch1受體胞內(nèi)結(jié)合域結(jié)合，可以促進(jìn)磷酸化Smad3蛋白的核易位。當(dāng)TGF-β信號(hào)途徑的表達(dá)受影響時(shí)，相關(guān)下游分子和Notch信號(hào)途徑的表達(dá)均受到影響，從而導(dǎo)致Foxp3表達(dá)下調(diào)。Notch的配體Jagged也可以調(diào)控Treg細(xì)胞，Jagged1過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)抑制性CD4+T細(xì)胞的分化，Jagged2可以通過(guò)Notch途徑推動(dòng)Treg細(xì)胞分化[9]。本研究結(jié)果顯示，KD急性組Notch1、Notch3、Jagged1、HES1 mRNA的表達(dá)水平低于KD治愈組和正常對(duì)照組(P<0.05)，而Jagged2 mRNA的表達(dá)水平與KD治愈組和正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。然后我們用Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示在HES1處理組中Notch及TGF-β途徑受體Notch1、Notch3、TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4的磷酸化蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在DAPT+HES1處理組中顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果說(shuō)明，靶基因HES1低表達(dá)和Notch信號(hào)異常有關(guān)，Notch信號(hào)途徑異?？赡芘cTreg細(xì)胞減少也有關(guān)，而HES1激活了Notch及TGF-β信號(hào)通路，誘導(dǎo)了途徑受體表達(dá)升高。

miRNA參與了細(xì)胞的代謝、增殖、分化及凋亡等過(guò)程，可以廣泛調(diào)節(jié)機(jī)體的生理、病理過(guò)程，與腫瘤、心血管疾病、遺傳性疾病等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。miRNA在致病機(jī)理的研究、疾病的診斷和治療方面的重要性越來(lái)越受到人們的關(guān)注[10]。本研究檢測(cè)血清miR-182表達(dá)水平與KD患兒臨床特征的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-182在血小板計(jì)數(shù)>300×109/L的急性期KD患兒血清中的表達(dá)水平低于血小板計(jì)數(shù)≤300×109/L的急性期KD患兒(P<0.05)，結(jié)果提示，急性川崎病(KD)血清中miR-182表達(dá)量相對(duì)較低，這種異常現(xiàn)象可能是其參與KD病理進(jìn)程，對(duì)KD具有調(diào)控功能。通過(guò)microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，預(yù)測(cè)HES1為miR-182的潛在靶基因，構(gòu)建了HES1野生型3’-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-HES1-wt及突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-HES1-Mut。將miR-182 mimics，negative control miRNA mimics (miR-NC)，內(nèi)參海腎熒光素酶以及pMIR-HES1-wt和pMIR-HES1-Mut報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)HCAEC細(xì)胞中，雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-182 mimics可顯著抑制pMIR-HES1-wt質(zhì)粒熒光素酶活性；而對(duì)pMIR-HES1-Mut熒光素酶活性無(wú)明顯影響。結(jié)果表明miR-182可以通過(guò)結(jié)合HES1的3’-UTR進(jìn)而抑制HES1的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-182對(duì)HES1的調(diào)控作用，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-182 mimics轉(zhuǎn)染組中HES1的mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，并且Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，miR-182 mimics轉(zhuǎn)染組中HES1蛋白表達(dá)水平顯著降低。上述結(jié)果表明miR-182能夠抑制HES1的mRNA翻譯及其蛋白表達(dá)。

綜上所述，miR-182可以通過(guò)下調(diào)HES1的表達(dá)抑制Notch與TGF-β信號(hào)途徑，可能導(dǎo)致Treg細(xì)胞減少，miR-182與HES1的靶向調(diào)控可能會(huì)成為急性川崎病檢測(cè)與治療醫(yī)學(xué)的新靶點(diǎn)。