黃芩苷對(duì)狼瘡鼠腎炎的治療作用和對(duì)濾泡輔助T細(xì)胞的調(diào)控作用

楊驥 楊雪 楊潔 李明

1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科，上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院風(fēng)濕科，上海 200040；3上海市血液中心 200051

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種病譜性的自身免疫性疾病，可累及多器官多系統(tǒng)。SLE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但免疫失衡與其發(fā)病密切相關(guān)。既往研究揭示，效應(yīng)性T細(xì)胞如分泌白細(xì)胞介素17（IL-17）的CD4+T（Th17）細(xì)胞、濾泡輔助性T（Tfh）細(xì)胞和分泌IL-9的CD4+T（Th9）細(xì)胞在SLE患者中增殖，并與狼瘡發(fā)病密切相關(guān)［1-7］。Tfh細(xì)胞主要輔助B細(xì)胞活化和抗體分泌，其與SLE中自身抗體分泌密切相關(guān)，因此可作為SLE的治療靶點(diǎn)［5-6，8-9］。既往研究表明，黃芩苷具有抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)作用，臨床一般用于急慢性肝炎的輔助治療［10-11］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）分化，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞分化和促炎效應(yīng)［12］。但迄今國(guó)內(nèi)外未見黃芩苷對(duì)狼瘡鼠動(dòng)物模型體內(nèi)外Tfh細(xì)胞的調(diào)控研究。本研究中我們首次通過狼瘡鼠模型研究黃芩苷對(duì)狼瘡腎炎的治療作用，并研究體內(nèi)外黃芩苷對(duì)狼瘡鼠Tfh細(xì)胞的調(diào)控作用，以進(jìn)一步明確黃芩苷在SLE臨床治療中的潛力。

材料與方法

一、材料

MRL/lpr狼瘡鼠來自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（滬）2003-0003；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（滬）2013-0039］，是由于Fas分子表達(dá)缺陷、淋巴細(xì)胞不能正常凋亡、T和B淋巴細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致的自身免疫炎癥損傷性模型；黃芩苷（相對(duì)分子質(zhì)量446.36）來自上海同田生物技術(shù)有限公司（純度98%，高效液相色譜法測(cè)定，生理氯化鈉溶液溶解備用）；CD4、C-X-C趨化因子受體5（CXCR5）、程序性死亡蛋白1（PD-1）和IL-21流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體均來自美國(guó)BD公司；離子霉素、佛波酯、布雷非德菌素A均來自美國(guó)Sigma公司；IL-6和IL-21來自美國(guó)Peprotech公司，PBS溶解后使用；抗CD3和CD28抗體來自美國(guó)BD公司；尿蛋白檢測(cè)試劑盒來自南京建成生物工程研究所。幼稚T細(xì)胞分選磁珠來自美國(guó)Life Technologies公司；流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD Bioscience公司產(chǎn)品。

二、方法

1.MRL/lpr狼瘡鼠和黃芩苷治療：8只12周齡雌性狼瘡鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，體重（29.9±2.6）g，通過隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組，每組4只。前期研究顯示，腹腔注射200 mg/kg黃芩苷可有效改善狼瘡腎炎病情［12］，因此本次體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣選用200 mg/kg黃芩苷腹腔注射每日1次，治療4周，對(duì)照組同法腹腔注射生理氯化鈉溶液。第4周治療結(jié)束時(shí)收集24 h尿液，通過考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白含量。然后處死小鼠，測(cè)量體重，摘取小鼠脾臟，從脾臟中分離單個(gè)核細(xì)胞，用標(biāo)記抗體異硫氰酸熒光素（FITC）-CD4、別藻藍(lán)蛋白（APC）-CXCR5和藻紅蛋白（PE）-PD-1常溫避光表面染色20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CXCR5+PD-1+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例。摘取小鼠腎臟，4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后行HE染色，按文獻(xiàn)［13］方法評(píng)估腎臟損傷情況。

2.體外Tfh細(xì)胞培養(yǎng)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)：從上述對(duì)照組狼瘡鼠脾臟中分離單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選幼稚CD4+T細(xì)胞，分為3組進(jìn)行體外培養(yǎng)，空白對(duì)照組不做處理，誘導(dǎo)組加入10 μg/L IL-21、IL-6及3 μg/L抗CD3和CD28抗體培養(yǎng)5 d，干預(yù)組在誘導(dǎo)組基礎(chǔ)上同時(shí)加入40 μmol/L黃芩苷體外培養(yǎng)5 d。用FITC-CD4、APC-CXCR5和PE-PD-1常溫避光表面染色20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CXCR5+PD-1+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例。用50 μg/L佛波酯、750 μg/L離子霉素和20 mg/L布雷非德菌素A刺激在上述培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的部分幼稚CD4+T細(xì)胞5 h后，收集細(xì)胞，用FITC-CD4常溫避光表面染色20 min，重懸細(xì)胞于通透液，PE-IL-21染色20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-21+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例。

3.統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。定量資料采用±s表示，通過方差分析和Studentt檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。顯著性水平α=0.05。

結(jié)果

一、黃芩苷治療狼瘡鼠狼瘡腎炎的療效

與對(duì)照組比較，黃芩苷腹腔注射治療4周能有效抑制狼瘡鼠腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度（圖1），黃芩苷組腎臟病理積分為3±0.82，對(duì)照組為5±0.82，經(jīng)Studentt檢驗(yàn)，t=2.828，P=0.018；兩組24h尿蛋白含量分別為（1 416±171）和（2 623±278）μg/24 h，經(jīng)Studentt檢驗(yàn)，t=6.204，P=0.022。

二、黃芩苷抑制狼瘡鼠體內(nèi)外Tfh分化

黃芩苷組狼瘡鼠脾臟重量（0.23±0.04）g，對(duì)照組（0.69±0.11）g，經(jīng)Studentt檢驗(yàn)，t=6.618，P=0.07。黃芩苷組狼瘡鼠脾臟中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞比例為12.6%±2.3%，對(duì)照組為40.2%±1.1%，兩組比較，t=14.9，P=0.005。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)干預(yù)組CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞和CD4+IL-21+細(xì)胞比例均低于誘導(dǎo)組（t值分別為2.64、18.03，P＜0.05或0.01）。見表1，圖2、3。

圖1 黃芩苷治療狼瘡鼠腎炎的療效（HE×40）1A：對(duì)照組；1B：黃芩苷組。黃芩苷組腎小球、腎小管和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕

討論

糖皮質(zhì)激素是SLE目前的主要治療藥物，但長(zhǎng)期使用可誘發(fā)一系列不良反應(yīng)。環(huán)孢素、環(huán)磷酰胺、他克莫司、嗎替麥考酚酯、雷公藤和生物制劑等免疫抑制劑也應(yīng)用于特定類型的SLE治療，但這些藥物常因價(jià)格昂貴或嚴(yán)重的不良反應(yīng)在臨床中的使用有限。因此尋找安全、有效且有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的治療藥物尤為重要。

SLE發(fā)病與自身抗體分泌增多、免疫復(fù)合物形成密切相關(guān)。Tfh細(xì)胞是一群輔助B細(xì)胞活化和促進(jìn)B細(xì)胞分泌抗體的重要細(xì)胞亞群［9］，主要存在于淋巴濾泡中。許多研究已經(jīng)證實(shí)，SLE患者外周血中存在多克隆Tfh細(xì)胞，且與SLE病情活動(dòng)和自身抗體分泌密切相關(guān)，因此Tfh細(xì)胞可作為SLE治療的有效靶點(diǎn)［2，9，14］，抑制Tfh細(xì)胞分化和功能可能進(jìn)一步阻止B細(xì)胞活化和自身抗體分泌。

黃芩苷是黃芩素的7-O-葡萄糖醛酸結(jié)合物，屬黃酮類化合物，既往研究提示，黃芩苷具有保肝、抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)作用［15-16］。我們前期證實(shí)，黃芩苷可抑制Th17細(xì)胞，促進(jìn)Treg細(xì)胞的增生，并可緩解關(guān)節(jié)炎癥損傷［17-18］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可有效降低狼瘡鼠24 h尿蛋白含量，緩解狼瘡鼠腎臟炎癥損傷，抑制狼瘡鼠脾臟增生，并有效抑制狼瘡鼠中Tfh細(xì)胞的增生。進(jìn)一步體外研究證實(shí)，黃芩苷可有效抑制Tfh細(xì)胞分化和IL-21產(chǎn)生，提示黃芩苷可能通過抑制Tfh細(xì)胞增生和效應(yīng)發(fā)揮治療狼瘡的作用。但是，黃芩苷是否通過氧化應(yīng)激途徑緩解狼瘡發(fā)病有待進(jìn)一步明確。總之，黃芩苷具有較明確的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，有希望應(yīng)用于SLE等自身免疫性疾病的治療。

表1 黃芩苷體外對(duì)狼瘡鼠Tfh細(xì)胞分化的影響（±s，%）

表1 黃芩苷體外對(duì)狼瘡鼠Tfh細(xì)胞分化的影響（±s，%）

組別空白對(duì)照組誘導(dǎo)組干預(yù)組F值P值只數(shù)4 4 4 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞1.8±0.5 17.6±0.9 13.3±0.8 2.64 0.04 CD4+IL-21+細(xì)胞0.2±0.1 2.7±0.2 1.0±0.4 18.03＜0.01

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)狼瘡鼠脾臟中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞比例黃芩苷組狼瘡鼠脾臟中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh比例低于對(duì)照組。PD-1：程序性死亡蛋白1；CXCR5：C-X-C趨化因子受體5

圖3 黃芩苷體外抑制狼瘡鼠Tfh細(xì)胞分化3A：40 μmol/L黃芩苷對(duì)CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞分化的影響；3B：40 μmol/L黃芩苷對(duì)CD4+IL-21+Tfh細(xì)胞分化的影響。PD-1：程序性死亡蛋白1；IL-21：白細(xì)胞介素21