補(bǔ)腎活血中藥對(duì)早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)屏障損傷的影響

王篤親 ，謝學(xué)軍 ，萬(wàn)李 ，張梅 ，羊潔 ，秦學(xué)維

糖尿病視網(wǎng)膜病變 (diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者并發(fā)癥中最為常見(jiàn)的一種微血管病變,是目前常見(jiàn)的致盲性眼病之一，而對(duì)DR的發(fā)病機(jī)制尚存爭(zhēng)論，近幾年國(guó)內(nèi)外圍繞DR的影響因素展開(kāi)了較為深入的研究，目前普遍認(rèn)為糖基化終末產(chǎn)物[1]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）[2]、蛋白激酶C活化[3]等均與DR發(fā)生有著密切關(guān)系。而血-視網(wǎng)膜屏障(Blood-retinal barrier，BRB)受損是DR產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)之一[4]。目前傾向認(rèn)為糖尿病患者的BRB出現(xiàn)障礙與血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障（internal blood-retinal barrier，iBRB）的損害有著密切聯(lián)系[5]。中醫(yī)藥防治DR一直是中醫(yī)眼科領(lǐng)域熱點(diǎn)，本研究將iBRB作為研究鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）引起早期糖尿病大鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜水腫的重要靶點(diǎn)，同時(shí)觀察補(bǔ)腎活血中藥對(duì)早期糖尿病大鼠iBRB損害的干預(yù)作用及機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用大鼠體質(zhì)量在200～250 g之間的SD大鼠150只（成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為清潔級(jí)），雌雄各75只。實(shí)驗(yàn)室室溫設(shè)置在18～28℃之間，相對(duì)濕度為40%～70%。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)均符合國(guó)家醫(yī)用研究動(dòng)物的使用標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑、藥物與儀器

試劑：羅丹明 B 及 Tris-base（Sigma Aldrich，美國(guó)），胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)），HE 染色試劑盒、4%多聚甲醛（翊圣生物科技，上海），PBS粉末、檸檬酸緩沖液（海標(biāo)科技，廈門），STZ（Sigma Aldrich，美國(guó)）。

儀器：血糖試紙（穩(wěn)豪型，上海強(qiáng)生公司），血糖儀（穩(wěn)豪倍易型，上海強(qiáng)生公司）。熒光顯微鏡（尼康50i型，日本），超純水系統(tǒng)（Merck Millipore，上海），離心機(jī)（Kendro Herzeus varifuge 3.0RS 型，美國(guó)），5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（Fermentas，美國(guó)），顯微鏡數(shù)碼照相系統(tǒng)（OlympusSZX16，蘇州），超凈工作臺(tái)、顯微手術(shù)器械（艾研生物科技，上海），體式解剖顯微鏡（艾研生物科技，上海），針芯式濾器(MilliporeФ0.22μm，美國(guó))。

補(bǔ)腎活血中藥組成：本實(shí)驗(yàn)所用補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方由干地黃、丹參、人參、葛根組成，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組 通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法將成功造模的糖尿病SD大鼠分為5組，分別為模型組（陰性對(duì)照組）、陽(yáng)性對(duì)照組、補(bǔ)腎活血中藥高劑量組、中劑量組及低劑量組。另設(shè)1組正常對(duì)照組，選取同齡SD大鼠，每組24只（雌雄不拘），與患糖尿病SD大鼠相同飼料方法喂養(yǎng)。陽(yáng)性對(duì)照組使用羥苯磺酸鈣片臨床常用量的10倍混懸液藥量進(jìn)行灌胃，高劑量中藥組使用補(bǔ)腎活血中藥臨床常用量的20倍等容積混懸液藥量進(jìn)行灌胃，中劑量組采用10倍等容積藥量，低劑量組采用5倍等容積藥量，正常對(duì)照組和模型組采用相同容積量的羥甲基纖維素灌胃。將6組大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為4個(gè)時(shí)間亞組，包括各組灌胃后的1周亞組、2周亞組、4周亞組及8周亞組，每個(gè)亞組都有至少4只大鼠。

觀察期間，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、補(bǔ)腎活血中藥高劑量組、中劑量組及低劑量組糖尿病大鼠持續(xù)使用高脂高糖飲食進(jìn)行喂養(yǎng)。灌胃后的1周、2周、4周、8周時(shí)取相應(yīng)時(shí)間亞組大鼠的視網(wǎng)膜，行消化酶血管鋪片、HE染色、糖原染色，并且通過(guò)對(duì)RHIC的檢測(cè)評(píng)估大鼠血-視網(wǎng)膜屏障的滲漏情況。

1.3.2 糖尿病大鼠造模方法 對(duì)SD大鼠進(jìn)行造模，環(huán)境為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，每只籠子內(nèi)飼養(yǎng)3只大鼠，所有大鼠均自由飲水，并使用高脂高糖飲食持續(xù)喂養(yǎng)1個(gè)月。糖尿病組SD大鼠禁食水12 h后腹腔注射 STZ 40 mg/Kg，并且用濃度 0.1 mmol/L、pH=4.5的檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行緩沖。72 h后在安靜環(huán)境下從大鼠尾靜脈取靜脈取血，測(cè)定SD大鼠的血糖值。血糖濃度＞11 mmol/L設(shè)為患糖尿病病鼠，3 d后檢測(cè)血糖并剔除血糖不達(dá)標(biāo)的大鼠，血糖水平符合標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病SD大鼠，每周測(cè)一次血糖及體重。

1.3.3 視網(wǎng)膜取材方法 大鼠進(jìn)行灌注,固定和取材,方法如下:（1）3%戊巴比妥鈉動(dòng)物腹腔注射麻醉。（2）沿腹正中線切開(kāi)胸腹壁,暴露心臟。 （3）18號(hào)鈍針頭插入左心室,剪開(kāi)右心耳,同時(shí)打開(kāi)雙腔管的生理鹽水端,灌注10～15 min直到從右心耳流出的液體變清亮后改為4%多聚甲醛灌注約20O ml。（4）完整取出眼球在放入2%多聚甲醛液中繼續(xù)固定12 h。（5）將眼球做成眼杯，小心取出完整視網(wǎng)膜。顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)的變化。

1.3.4 羅丹明(RHIC)法檢測(cè)血視網(wǎng)膜屏障滲漏 （1）每只大鼠一次性腹腔注射羅丹明5 μl(劑量:1%RHIC/g體重,用無(wú)菌生理鹽水溶解,用前配制)。（2）注射完畢后,將大鼠送回籠子,自由攝取食物和水,避光。（3）在羅丹明注射6 h后,對(duì)大鼠進(jìn)行灌裝取材，方法同前。（4）次日,行眼球冠狀冰凍切片,切片厚10μm切片貼附于明膠包被的載玻片上,放置于空氣中干燥，避光保存于-20℃冰柜中。（5）-20℃冰柜中取出切片室溫下避光放置30 min。（6）4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核,防熒光淬滅劑封片,顯微鏡下拍片觀察視網(wǎng)膜各層RHIC的滲漏情況。

1.4 觀察指標(biāo)

視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變：顯微鏡下觀察不同組大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)的變化。

血視網(wǎng)膜屏障滲漏情況：顯微鏡下拍片觀察各組中大鼠視網(wǎng)膜各層RHIC的滲漏情況

2 結(jié)果

2.1 大鼠視網(wǎng)膜血管的形態(tài)學(xué)變化

正常對(duì)照組：低倍鏡下可觀察到血管網(wǎng)較為完整，視神經(jīng)乳頭周邊動(dòng)、靜脈及毛細(xì)血管網(wǎng)較為明顯，動(dòng)脈主干染色明顯、靜脈染色淺，動(dòng)脈主干直徑細(xì)，而靜脈管徑相對(duì)較粗。動(dòng)脈周圍血管網(wǎng)顯著少于靜脈。后極部的毛細(xì)血管網(wǎng)排列較為致密，周邊部的毛細(xì)血管網(wǎng)呈放射狀分布。采用高倍鏡進(jìn)行進(jìn)一步觀察：周細(xì)胞核小，染色深；內(nèi)皮細(xì)胞核較大，染色淺，兩細(xì)胞存在比例相同（圖1A）。

與正常對(duì)照組各時(shí)間亞組大鼠的視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)相比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、補(bǔ)腎活血中藥高、中、低劑量組中的1周亞組、2周亞組、4周亞組及8周亞組大鼠的視網(wǎng)膜的血管形態(tài)均未見(jiàn)明顯差異（圖 1B）。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)變化 （×40）1A正常組大鼠；1B補(bǔ)腎活血中藥低劑量組

2.2 大鼠血-視網(wǎng)膜屏障滲漏的情況

正常對(duì)照組：大鼠各周亞組中視網(wǎng)膜各層均未出現(xiàn)RHIC滲漏的情況。

比較各組2周亞組,陽(yáng)性對(duì)照組、補(bǔ)腎活血中藥高劑量組、中劑量組及低劑量組、模型組均可見(jiàn)RHIC滲漏出現(xiàn)在外叢狀層、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和神經(jīng)纖維層，其中以模型組RHIC滲漏最多，補(bǔ)腎活血中藥中、高劑量組RHIC滲漏情況相近且僅次于模型組，補(bǔ)腎活血中藥低劑量組RHIC滲漏量低于中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組RHIC滲漏最少。各組大鼠第4周亞組RHIC滲漏比第2周亞組RHIC滲漏更加顯著，外叢狀層、內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和神經(jīng)纖維層各層均有RHIC滲漏，其中以模型組RHIC滲漏最多，補(bǔ)腎活血中藥中、高劑量組RHIC滲漏情況相近且僅次于模型組，補(bǔ)腎活血中藥低劑量組RHIC滲漏量低于補(bǔ)腎活血中藥中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組RHIC滲漏最少。各組大鼠第8周亞組RHIC滲漏較第4周亞組RHIC滲漏更加明顯：其中以模型組RHIC滲漏最多，補(bǔ)腎活血中藥中、高劑量組RHIC滲漏情況相近且僅次于模型組，補(bǔ)腎活血中藥低劑量組RHIC滲漏量低于補(bǔ)腎活血中藥中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組RHIC滲漏最少。（圖2中A-F）

圖2 各組第8周大鼠血-視網(wǎng)膜屏障滲漏光學(xué)顯微鏡圖（×40）。2A 正常對(duì)照組（箭頭所指無(wú)滲漏區(qū)）；2B模型組 （箭頭所指RHIC滲漏區(qū)域?yàn)榧t色）；2C陽(yáng)性對(duì)照組（箭頭所指無(wú)滲漏區(qū)）；2D 補(bǔ)腎活血中藥低劑量組；2E補(bǔ)腎活血中藥中劑量組；2F補(bǔ)腎活血中藥高劑量組。RHIC：羅丹明

3 討論

3.1 糖尿病視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)改變的意義

糖尿病早期視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)的病理學(xué)改變是周細(xì)胞減少至消失和微血管瘤形成，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞數(shù)量的減少的同時(shí)會(huì)降低糖尿病患者血-視網(wǎng)膜屏障作用，又反而加速了視網(wǎng)膜微血管瘤和新生血管的形成，進(jìn)一步導(dǎo)致周細(xì)胞數(shù)量的下降，造成惡性循環(huán)[6]。

本研究選用嚙齒類動(dòng)物-大鼠，所有糖尿病大鼠模型均通過(guò)高脂高鹽飲食和STZ誘導(dǎo)建立糖尿病模型,主要由于相同病因機(jī)制情況下，嚙齒類動(dòng)物最先出現(xiàn)周細(xì)胞的缺失[7],導(dǎo)致血管通透性的增加，這與人類在該病的發(fā)病機(jī)制有相似之處[8]。本研究血管鋪片結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)完整，在視網(wǎng)膜后極部的血管網(wǎng)排列尤為致密，視網(wǎng)膜周邊部血管網(wǎng)呈發(fā)散分布。本研究發(fā)現(xiàn)模型組、補(bǔ)腎活血中藥高、中、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組中各組的1周亞組、2周亞組、4周亞組、8周亞組與正常對(duì)照組各時(shí)間亞組視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)比較均無(wú)明顯差異。國(guó)內(nèi)外對(duì)此現(xiàn)象研究報(bào)道較為充分：國(guó)外有學(xué)者研究證實(shí)[9]糖尿病發(fā)生后，對(duì)于Lewis及Wistar大鼠都有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失現(xiàn)象的發(fā)生，但SD大鼠則未見(jiàn)改變[10]。施沃棟等[11]的研究顯示，成功建立糖尿病動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)且病程1個(gè)月及以上的大鼠，其視網(wǎng)膜的厚度均已可見(jiàn)明顯降低；病理學(xué)基礎(chǔ)變化主要表現(xiàn)為視神經(jīng)元的變性或凋亡，但無(wú)微血管瘤的發(fā)現(xiàn)。但與患有糖尿病大鼠不同的是，臨床發(fā)現(xiàn)早期糖尿病患者，無(wú)法運(yùn)用現(xiàn)有醫(yī)學(xué)檢查手段發(fā)現(xiàn)患者內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度的改變。另有研究顯示，患糖尿病2周后，患者可出現(xiàn)視網(wǎng)膜功能的改變，iBRB開(kāi)始逐步受累、功能障礙[12-13]。

3.2 糖尿病血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障損傷

血-視網(wǎng)膜屏障損傷是導(dǎo)致非增殖型糖尿病性視網(wǎng)膜病向增殖型糖尿病性視網(wǎng)膜病轉(zhuǎn)變尤為關(guān)鍵的因素，同時(shí)也是非增殖型糖尿病性視網(wǎng)膜病的顯著病理學(xué)特征，臨床上通過(guò)減輕或抑制非增殖型糖尿病性視網(wǎng)膜病患者血-視網(wǎng)膜屏障損傷，可以起到糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期防治。

本研究結(jié)果顯示：早期糖尿病大鼠外叢狀層至神經(jīng)纖維層都存在RHIC滲漏，而外層視網(wǎng)膜并未發(fā)現(xiàn)滲漏。采用中藥補(bǔ)腎活血復(fù)方后，可以有效減少RHIC的滲漏，從而緩解iBRB功能被損害，進(jìn)而緩解模型大鼠視網(wǎng)膜水腫癥狀。導(dǎo)致血管滲漏的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其周圍細(xì)胞基質(zhì)的損害。VEGF是血管生長(zhǎng)因子大家族的重要成員，1994年有研究首次報(bào)道了關(guān)于其在糖尿病視網(wǎng)膜血管病中的重要性。臨床研究表明：糖尿病視網(wǎng)膜病變患者增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變患者房水和玻璃體中VEGF的高表達(dá)[14]，而臨床對(duì)于非增殖期的研究病例較難獲得，研究較少，因此需要通過(guò)理論依據(jù)建造動(dòng)物模型進(jìn)行研究支撐。iBRB損傷和視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞數(shù)量減少引發(fā)視網(wǎng)膜血管通透性增加是患者在非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變視力喪失的另一原因。國(guó)內(nèi)外相關(guān)[15]研究表明，高脂高糖飲食和STZ誘導(dǎo)的SD大鼠糖尿病模型，在SD大鼠糖尿病發(fā)病后10 d，即可出現(xiàn)視網(wǎng)膜通透性增高；而在DM BN大鼠發(fā)病后10 d，可出現(xiàn)連續(xù)性的視網(wǎng)膜血管滲漏，說(shuō)明了遺傳差異與大鼠種屬類別無(wú)關(guān)，反而可能與糖尿病iBRB破壞的易感性改變密切關(guān)聯(lián)。有研究在成年患糖尿病的靈長(zhǎng)類動(dòng)物的玻璃體內(nèi)注入外源性VEGF，可出現(xiàn)非增殖期視網(wǎng)膜病變的眼底改變，并且這種糖尿病視網(wǎng)膜病變靈長(zhǎng)類動(dòng)物的眼底變化程度與外源性VEGF注射量呈正相關(guān)，表明VEGF在糖尿病的非增殖期病變中也存在相應(yīng)的影響機(jī)制，新生血管的生成、i-BRB破壞等與VEGF密切相關(guān)[16]。李艷等[17]實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，患糖尿病后第2周的SD大鼠，其靜脈血VEGF含量顯著增高，且iBRB損傷明顯，表明VEGF生長(zhǎng)因子具有的血管通透性較強(qiáng)，而導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管滲漏加重。糖尿病的病程如不積極進(jìn)行控制，隨著病程的延長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致并加重iBRB損傷和視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能的改變。

本研究結(jié)果表明糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期防治應(yīng)作為臨床治療的關(guān)鍵,需要定期進(jìn)行眼底造影及實(shí)驗(yàn)室檢查。早期注重改善患者微血管循環(huán)，降低或阻止視網(wǎng)膜微血管細(xì)胞的喪失和功能降低，從而能夠阻止或減少糖尿病視網(wǎng)膜病變患者無(wú)細(xì)胞性微血管的形成。