益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜RGCs凋亡相關因子表達的影響

張兆康 ，倘孟瑩 ，滕月 ，張麗霞

青光眼（glaucoma）是一種嚴重的致盲性眼病，視功能多呈進行性、不可逆性損害。目前認為青光眼的病理基礎是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞 （retina ganglion cells，RGCs）的進行性丟失。大量的臨床與基礎研究表明，細胞凋亡是青光眼視神經(jīng)節(jié)細胞丟失的主要途徑[1-4]。細胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展受多種基因調(diào)控，包括凋亡抑制基因和凋亡促進基因，Bcl-2和Bax分別是這兩類基因中的典型代表。Caspase家族在細胞凋亡中也起著重要作用，Caspase-3屬于凋亡效應亞類，直接促使細胞凋亡，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白”。課題前期發(fā)現(xiàn)益精杞菊地黃顆粒劑對慢性高眼壓大鼠RGCs的凋亡有明顯的保護作用[5]，為了進一步探討益精杞菊地黃顆?？筊GCs的凋亡作用機制，應用免疫組織化學技術及Real Time-PCR檢測技術觀察益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax和Caspase-3表達的影響，為臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠7～8周齡60只,體重約 180～220 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供?！耙婢骄盏攸S顆?！庇设坭阶优浞筋w粒、菊花配方顆粒、熟地黃配方顆粒、山萸肉配方顆粒、澤瀉配方顆粒、茯苓配方顆粒、黃芪配方顆粒等組成，由中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院藥劑科提供，加適量水溶解，無菌密封后放入4℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及給藥 將 “益精杞菊地黃顆?！迸R床成人劑量（mg/kg）的 5倍、10倍、20倍，分別定為低劑量組、中劑量組、高劑量中藥組，每組大鼠各12只，中藥高、中、低劑量組分別給予不同濃度的顆粒劑灌胃給藥。模型組與對照組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 高眼壓動物模型的建立 根據(jù)燒灼鞏膜上靜脈法制成慢性高眼壓模型[6-7]，術前左氧氟沙星眼藥水沖洗眼部（右眼）消毒，于上瞼中點做牽引縫線以拉開眼瞼。在顯微鏡下，沿角膜緣外2 mm處行放射狀的切口剪開外側及上方球結膜，仔細分離筋膜和肌肉，可發(fā)現(xiàn)暴露鼻上、顳上和顳下象限2或3條鞏膜上靜脈，用眼科手術止血器燒灼這3支鞏膜上靜脈，烙閉成功的標志即燒灼處靜脈血流消失，近端靜脈充血怒張。術后用生理鹽水沖洗結膜囊，平復球結膜，復方妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。大鼠的平均眼壓在22 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上者則為造模成功。

1.2.3 取材及標本制備 將大鼠過量麻醉處死，快速摘取右眼眼球，留取部分球后視神經(jīng)組織，4℃環(huán)境下4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋備免疫組化用。過量麻醉大鼠后，無菌條件下摘除大鼠眼球，自角膜緣剪開去除角膜、晶狀體、玻璃體，取出視網(wǎng)膜，放入無RNAse的離心管中，立即置-80℃冰箱中凍存，備Real-Time PCR實驗用。

1.3 檢測方法

1.3.1 疫組織化學染色 石蠟切片常規(guī)脫臘至水化，進行抗原修復后脫水透明，中性樹膠封片固定；光鏡下分別觀察大鼠RGCs中凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達情況,并利用Leica DM 2500顯微鏡Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件來進行圖像采集和處理，每張切片隨機取5個高倍視野照相，所得的平均光密度值作為Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的陽性表達水平。

1.3.2 Real Time-PCR檢測 用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）進行反轉錄反應。以RNA模板進行RT-PCR定量檢測，擴增程序為：95 ℃預變性 60 s，（95℃ 15 s，60 ℃60 s）×40個循環(huán)。采用2-△△ct方法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析，△△ct=（實驗組目的基因平均ct值-實驗組內(nèi)參基因平均ct值）-（對照組目的基因平均ct值-對照組內(nèi)參基因平均ct值)。觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織中 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA 的表達。

表1 Bcl-2、Bax、Caspase-3 基因引物序列

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，定量指標以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示。 多組間的比較用完全隨機設計的單因素方差分析（One-way ANOVA）。兩組間的多重比較，采用LSD-t檢驗，各組與對照組或模型組的比較，采用Dunnett t檢驗(2-sided)。自身的前后對照比較用配對t檢驗,若P＜0.05，則認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色法檢測各組大鼠RGCs中Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白的表達

干預1個月后，空白組大鼠RGCs中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達較少，呈散在棕黃色顆粒狀。模型組大鼠RGCs中Bcl-2略有表達，Bax、Caspase-3明顯表達。中藥中劑量組大鼠RGCs中Bcl-2明顯表達，Bax、Caspase-3略有表達。中藥高、中劑量組大鼠RGCs中Bcl-2表達多，Bax、Caspase-3表達少（表 2，圖 1）。

各組大鼠RGCs中Bcl-2陽性表達平均IOD（平均積分光密度）值。與空白組相比，中藥治療組、模型組均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，中劑量中藥組的抗凋亡基因Bcl-2表達顯著增多（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義；而高、低劑量組 Bcl-2表達與模型組比較，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2，圖 1）

各組大鼠RGCs中Bax陽性表達和平均IOD值和Caspase-3陽性表達平均IOD值。與空白組相比，中藥治療組、模型組Bax、Caspase-3表達均增多（P＜0.01），有統(tǒng)計學意義。與模型組相比，中劑量中藥組促凋亡基因Bax、Caspase-3的表達顯著減少（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義；高、低劑量組 Bax、Caspase-3表達與模型組比較，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 （表 2，圖 1）

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中凋亡相關因子mRNA的相對表達量

表2 各組大鼠RGCs中凋亡相關因子IOD值比較（xˉ±s，n=12）

圖1 光學顯微鏡下各組大鼠RGCs中Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達（免疫組化染色×40）

Bcl-2 mRNA：與空白組相比，中藥治療組、模型組均有顯著性差異（P＜0.01），有統(tǒng)計學意義。與模型組相比，中藥中劑量組、低劑量組的Bcl-2 mRNA相對表達量顯著增多（P＜0.01），有顯著保護作用；高劑量組Bcl-2 mRNA相對表達量與模型組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 （表 3，圖 1）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中凋亡相關因子mRNA的相對表達量比較（，n=6）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中凋亡相關因子mRNA的相對表達量比較（，n=6）

注：*與模型組比較，表示P＜0.05；#與空白組比較，P＜0.05

組別 mRNA表達量Bcl-2 Bax Caspase-3空白組 0.593±0.083* 0.499±0.005* 0.641±0.047*模型組 1.126±0.203# 1.333±0.257# 1.503±0.029#高劑量中藥組 1.333±0.086# 1.296±0.155# 1.429±0.047#中劑量中藥組 2.026±0.161*# 0.960±0.072*# 1.123±0.015*#低劑量中藥組 1.750±0.111*# 1.036±0.077*# 1.426±0.071#F 49.37 16.54 178.76 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

Bax mRNA：中藥治療組、模型組與空白組相比，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，中劑量中藥組的Bax mRNA相對表達量顯著減少 （P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義；低劑量中藥組的Bax mRNA相對表達量減少（P＜0.05）;而高劑量組與模型組比較，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

Caspase-3 mRNA：中藥治療組、模型組與空白組相比，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，中劑量中藥組的Caspase-3 mRNA相對表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而高、低劑量組與模型組相比，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

3.1 Bcl-2、Bax和Caspase-3在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡中的作用

細胞凋亡發(fā)生、發(fā)展受多種基因調(diào)控，目前認為與RGCs凋亡相關的基因中，以Bcl-2、Bax和Caspase-3最為典型[8]。Bcl-2家族包括抑制細胞凋亡的（Bcl-2，Bcl-xl等）和促進細胞凋亡的（Bax、Bad 等）兩類蛋白亞群。Bcl-2基因，即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因，是比較重要的抗凋亡基因，而Bax可促進細胞凋亡，是典型的凋亡促進基因。Caspase家族在細胞凋亡中也起著重要作用，Caspase-3屬于凋亡效應亞類，位于級聯(lián)反應的下游，是凋亡途徑的共同下游部分，直接促使細胞凋亡，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白”。Bcl-2、Bax作為Caspase-3的上游調(diào)控機制，其表達能抑制各種因素所誘發(fā)的Caspase-3的激活和凋亡。在燒灼上鞏膜靜脈法誘導的慢性青光眼大鼠模型中發(fā)現(xiàn)[9]，模型眼較正常眼視網(wǎng)膜中Bcl-2蛋白的表達增多，治療組較高眼壓組Bcl-2表達顯著增加，說明Bcl-2可能參與了青光眼RGCs凋亡及視神經(jīng)保護的機制。

通過本實驗表明，Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白在空白對照組RGCs中有少量表達；高眼壓模型組和中藥治療組RGCs中bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達均較對照組增多；Bcl-2表達中藥中劑量組較模型組顯著性增加，Bax和Caspase-3蛋白的表達中藥中劑量組較模型組顯著性減少。因此我們選擇bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達作為評價指標。Bcl-2在RGCs中的作用機制主要是通過抑制細胞色素C釋放、下調(diào)細胞內(nèi)的Ca2+水平、抑制星形膠質(zhì)細胞的活化等保護視神經(jīng)節(jié)細胞。而Bax可促使視神經(jīng)軸突損傷，維持電壓依賴性陰離子通道的開放使線粒體外膜完整性丟失。Caspase-3主要在凋亡誘導信號作用下，其效應被激活，水解細胞內(nèi)靶物質(zhì)，降解細胞內(nèi)蛋白，則引起細胞凋亡。

3.2 探討益精杞菊地黃顆粒對慢性高眼壓大鼠RGCs的作用機制

益精杞菊地黃顆粒劑由杞菊地黃丸化裁而成。杞菊地黃丸源于《醫(yī)級》，在經(jīng)典方劑六味地黃丸的基礎上加枸杞子、菊花而成，具有滋陰、養(yǎng)肝、明目之效。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)益精杞菊地黃顆粒在一定程度上可減少RGCs凋亡，對青光眼神經(jīng)節(jié)細胞減少。同樣RT-PCR法檢測顯示，中劑量組中藥較模型組Bcl-2 mRNA的相對表達量顯著增多，Bax mRNA、Caspase-3 mRNA的相對表達量顯著減少，均有統(tǒng)計學意義。值得注意的是，本實驗中各用藥組眼壓輕度下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此，益精杞菊地黃顆?？赡芡ㄟ^上調(diào)Bcl-2的表達，下調(diào)Bax、Caspase-3的表達，來發(fā)揮其保護RGCs的作用，并不是通過降低眼壓來實現(xiàn)的。至于其確切機制是否與其他凋亡因子有關，還需進一步研究。由上所述，益精杞菊地黃顆粒通過調(diào)控基因蛋白，對抗視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡，從而保證視功能正常發(fā)揮。