中-低強(qiáng)度噪聲暴露對耳蝸帶狀突觸的影響

王園園 孫毓晗 柳柯 孔婷婷*

1牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(牡丹江157011)

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(北京100050)

3北京市臨床醫(yī)學(xué)研究所耳鼻咽喉頭頸外科研究室(北京100050)

噪聲性聽力損失(Noise induce hearing loss，NIHL)又稱噪聲性耳聾(Noise induced deafness)，是因長期暴露于損害性噪聲環(huán)境所致內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷為主要機(jī)制的一種感音神經(jīng)性耳聾[1]。近些年，隨著社會(huì)工業(yè)化和現(xiàn)代化的發(fā)展，噪聲污染日益嚴(yán)重。據(jù)估計(jì)，全球超過12%的人口面臨著聽力損失的風(fēng)險(xiǎn)，其中三分之一病例可歸因于噪聲暴露[2]。在傳統(tǒng)觀念上，噪音暴露或衰老導(dǎo)致的“聽力損失”常會(huì)引起聽覺閾值的改變，這種閾值的升高一般認(rèn)為是由毛細(xì)胞受損造成的。然而近些年的臨床和基礎(chǔ)研究則顯示很多情況下的聽力損失并不一定伴隨閾值的升高，或者閾值在升高一段時(shí)間后又恢復(fù)至正常水平。這種發(fā)現(xiàn)對解釋目前臨床上一些較為棘手的聽覺問題提供了新的視角，也為未來的聽覺疾病研究提供了新的線索。本文將對近年來國內(nèi)外對中-低等強(qiáng)度噪聲暴露對耳蝸帶狀突觸可塑性影響的文獻(xiàn)進(jìn)行簡要綜述。

1 耳蝸帶狀突觸特征

神經(jīng)細(xì)胞依賴于神經(jīng)突觸(synapses)進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞[3]。在電鏡下觀察到，突觸部位有兩層膜性結(jié)構(gòu)，分別為突觸前膜和突觸后膜，兩膜之間為突觸間隙。在靠近前膜的突觸囊泡內(nèi)含有神經(jīng)遞質(zhì)，外界聲音刺激后，突觸前膜發(fā)生去極化，使神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前釋放到突觸間隙中，與突觸后膜上的谷氨酸受體相互作用，從而完成聲音信號(hào)在聽神經(jīng)上的興奮性傳導(dǎo)[4]。內(nèi)毛細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞膜上具有谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST)，當(dāng)谷氨酸過量時(shí)，GLAST將過多的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，在谷氨酸合成酶的作用下合成谷氨酰胺，從而維持突觸間隙谷氨酸的平衡[5]。

1.1 帶狀突觸超微結(jié)構(gòu)

Ribbon突觸是突觸前膜的一種帶狀電子致密物，這種致密體周圍由谷氨酸填充的突觸囊泡附著，因其呈帶狀而被命名[6，7](如圖1)。研究表明，小鼠在出生時(shí)，內(nèi)、外毛細(xì)胞上即可觀察到可標(biāo)記的突觸信號(hào)，該信號(hào)呈大小不等圓點(diǎn)狀，不均勻地分布于毛細(xì)胞胞質(zhì)和基底側(cè)膜上[8]。內(nèi)毛細(xì)胞通過帶狀突觸將不同的聲音信號(hào)傳遞給聽覺傳入神經(jīng)，不同強(qiáng)度及頻率的聲音刺激產(chǎn)生不同程度的去極化，此時(shí)突觸帶狀體結(jié)構(gòu)可保證與刺激方式相匹配的神經(jīng)遞質(zhì)釋放活動(dòng)，從而確保聲刺激信號(hào)的差異化在興奮性傳導(dǎo)過程中得到維持（fidelity），這正是耳蝸對聲音信號(hào)編碼的本質(zhì)特征之一。

早在1955年，De Robertis和Bennett等[9]首先在豚鼠視網(wǎng)膜的突觸前膜發(fā)現(xiàn)了一種顆粒狀或泡狀結(jié)構(gòu)，定義為“突觸囊泡”。1956年，De Robertis[9]在兔視網(wǎng)膜光感受器的研究中發(fā)現(xiàn)了突觸囊泡的數(shù)量與突觸前膜活動(dòng)相關(guān)性的首個(gè)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。在電鏡下觀察到，突觸前膜和突觸后膜的厚度一般只有7nm左右，間隙為20nm左右。在靠近前膜的軸漿含有線粒體和突觸囊泡，囊泡的直徑為30～60nm。有學(xué)者觀察到，哺乳動(dòng)物耳蝸帶狀突觸上可以聚集100-200個(gè)突觸囊泡[10]。形態(tài)上，突觸囊泡可分為三種類型:I、錨定囊泡(docked vesicle）:即囊泡與突觸的漿膜層緊密相連；II、與帶狀突觸相連的囊泡(ribbon-associated vesicle)；III、游離的突觸囊泡(free cytosolic vesicle）[11]。

圖1 帶狀突觸形態(tài)：a、b、c為8周齡小鼠毛細(xì)胞帶狀突觸電子顯微圖（帶狀結(jié)構(gòu)附著在質(zhì)膜上，周圍是突觸囊泡）；d為用電子斷層掃描重建的蛙毛細(xì)胞突觸截面；e為突觸三維結(jié)構(gòu)[7]。Fig.1 morphologyofribbonsynaptic：a,bandcaretheelectron micrographs of ribbon synapses in hair cells of 8-week-old mice(ribbons attached to the plasma membrane,surrounded by synaptic vesicles)；d are the synaptic sections of frog hair cells reconstructed by electron tomography；e is the three-dimensional structure of synapses[7].

1.2 帶狀突觸形態(tài)及數(shù)量

帶狀突觸多存在于動(dòng)物視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞、雙極細(xì)胞，內(nèi)毛細(xì)胞及松果體細(xì)胞中，具有形態(tài)特異性，其形態(tài)可以為球形、橢圓形或長方體形[11]，大小不一。非哺乳類動(dòng)物毛細(xì)胞帶狀突觸直徑為200-400nm，而哺乳類動(dòng)物毛細(xì)胞帶狀突觸直徑≤200nm[12]。在哺乳動(dòng)物耳蝸中，不同的空間位置和生理狀態(tài)下,帶狀突觸的形態(tài)、大小及數(shù)量均有所不同，甚至在同一動(dòng)物的不同發(fā)育階段也會(huì)有很大差異[13]。毛細(xì)胞的形態(tài)與其功能性質(zhì)也有一定相關(guān)性，耳蝸高頻和低頻區(qū)域上帶狀突觸的結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致了空間分布不同的帶狀突觸的胞吐作用對鈣離子的依賴性不同，研究發(fā)現(xiàn)高頻區(qū)域的帶狀突觸表面積更大[14]。在小鼠耳蝸中，每個(gè)IHC一般有10-20個(gè)帶狀突觸，每個(gè)突觸結(jié)構(gòu)與不同的I型神經(jīng)元末梢接觸[15]。柳柯等[16]應(yīng)用三維建模方法定量分析小鼠耳蝸內(nèi)帶狀突觸的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量平均為（16.10±1.032）個(gè)，與之前研究人員證實(shí)的內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量平均值近似。

1.3 帶狀突觸的分子組成

由于耳蝸帶狀突觸標(biāo)本取材難度較大，因而對其組成的研究較少。近年來已知的哺乳動(dòng)物帶狀突觸的蛋白結(jié)構(gòu)主要包括Ribeye,Bassoon,Piccolo,Rab3,KIF3A，Shank1以及PSD95等[17]。目前對這些蛋白結(jié)構(gòu)在帶狀體上的功能還不是很明確，研究人員傾向認(rèn)為它們可能是聽覺傳入的重要調(diào)節(jié)因子。其中Ribeye是帶狀突觸上唯一已知的結(jié)構(gòu)蛋白，脊椎動(dòng)物Ribeye蛋白均為C-末端的結(jié)合蛋白（CtBP2）基因的亞型[7]，羧基端的B結(jié)構(gòu)域與CtBP2具有同源性，獨(dú)特的氨基端A結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸，目前猜測其作用可能是構(gòu)成帶狀突觸結(jié)構(gòu)的骨架蛋白，然而在已知的基因庫里尚未發(fā)現(xiàn)其同源基因[18]。Rab3反應(yīng)蛋白對于啟動(dòng)囊泡釋放和Ca2+依賴性囊泡釋放具有重要的作用[19]。Bassoon蛋白位于突觸前膜活性區(qū)和帶狀體之間，推測其作用同Piccolo蛋白相似，可能與將帶狀體錨定于活性區(qū)有關(guān)[14]。KIF3A是驅(qū)動(dòng)蛋白Ⅱ的構(gòu)成部分[20]，因在帶狀突觸上只找到了KIF3A，而未找到驅(qū)動(dòng)蛋白Ⅱ的其他構(gòu)成部分，因此該蛋白對帶狀突觸的具體功能至今還不清楚。

1.4 帶狀突觸可塑性

帶狀突觸屬于一種動(dòng)態(tài)變化的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)改變可由自身因素或外界環(huán)境改變所引起。即使在同一種細(xì)胞類型上，突觸的數(shù)量、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能也可能不同。Ribeye蛋白的表達(dá)量和帶狀體的體積均與其結(jié)構(gòu)的可塑性相關(guān)[21]。帶狀突觸結(jié)構(gòu)的改變也反映了其功能的變化。在噪聲暴露時(shí)，耳蝸帶狀突觸的數(shù)量會(huì)即刻出現(xiàn)變化，隨著時(shí)間的延長或暴露強(qiáng)度的降低，帶狀突觸的數(shù)量會(huì)逐漸恢復(fù)。黑暗條件下視網(wǎng)膜上帶狀突觸釋放大量神經(jīng)遞質(zhì)，此時(shí)帶狀突觸體延伸變長；光照條件下視網(wǎng)膜上帶狀突觸收縮變短，突觸的胞吐功能降低[21]。

2 噪聲暴露及內(nèi)耳信號(hào)傳導(dǎo)

聲音刺激后，耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞將聲音刺激所致的基底膜振動(dòng)轉(zhuǎn)化為膜電位變化，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)在突觸區(qū)釋放，激活傳入聽神經(jīng)纖維興奮性神經(jīng)沖動(dòng)。每根聽纖維通常不分支，并僅與一個(gè)IHC形成突觸連接。研究表明每個(gè)IHC由10-20個(gè)聽覺神經(jīng)末梢支配，其中約50%的神經(jīng)末梢即使在閾值無改變的情況下也可受到損傷并消失[11，22]。噪聲根據(jù)其暴露強(qiáng)度分為不同等級(jí)，一般認(rèn)為，聲強(qiáng)大于110dB的為強(qiáng)噪聲，低于110dB的為低中等強(qiáng)度噪聲。目前噪聲所致感音神經(jīng)性耳聾(SNHL)的相關(guān)研究較多，但由于噪聲性耳聾的病理機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多器官、多部位以及多個(gè)分子通路，其確切的機(jī)制現(xiàn)在仍不明確。多數(shù)人所認(rèn)同的是，噪聲性耳聾首先出現(xiàn)Corti器的機(jī)械性損傷改變，后繼發(fā)耳蝸內(nèi)局部組織的多種病理性改變，其中最主要的是毛細(xì)胞代謝及神經(jīng)功能異常。近年研究發(fā)現(xiàn)，不同強(qiáng)度和種類的噪聲以及耳毒性藥物都可以對耳蝸帶狀突觸造成損害。

3 耳蝸帶狀突觸是中-低強(qiáng)度噪聲損害重要靶點(diǎn)

早些年對噪聲誘導(dǎo)的永久性閾移(PTS)研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露會(huì)對Corti器與SGNs產(chǎn)生損害[23]。一定強(qiáng)度噪聲暴露可導(dǎo)致耳蝸IHCs底部區(qū)域出現(xiàn)廣泛腫脹和空泡化，這些腫脹和空泡結(jié)構(gòu)與可識(shí)別的突觸前結(jié)構(gòu)連接；在暴露后較長時(shí)間點(diǎn)再次觀察，發(fā)現(xiàn)IHCs底部區(qū)域腫脹消失或減輕，此時(shí)聽覺閾值已恢復(fù)正常，耳蝸神經(jīng)軸突或螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞也無明顯喪失，人們因此認(rèn)為這些噪聲損傷的神經(jīng)末梢已經(jīng)恢復(fù)或再生[24]。但近年來，多項(xiàng)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噪聲誘導(dǎo)的閾值變化和毛細(xì)胞損傷完全可逆時(shí)，IHCs和聽神經(jīng)纖維之間的許多突觸連接可能被永久性破壞[25，26]。這種現(xiàn)象已在小鼠[26]、豚鼠[27]和人類[28]個(gè)體上得到證實(shí)。

過度的噪聲刺激會(huì)引起自由基或活性氧(ROS)的形成及谷氨酸的興奮性毒性作用，隨后信號(hào)通路的激活導(dǎo)致細(xì)胞死亡[29]。ROS在噪聲暴露后立即出現(xiàn)，存在于Corti器的基底膜上，并可持續(xù)存在7-10天，因此增大了細(xì)胞受損的可能性[1,30]。谷氨酸除了對突觸后膜具有快速興奮性和營養(yǎng)作用之外，在缺血和噪聲損傷的病理狀態(tài)下還對突觸后膜和鄰近支持細(xì)胞具有損害作用[31]。暴露于噪聲刺激后，IHC突觸前膜會(huì)釋放過量的谷氨酸，持續(xù)作用于突觸后膜的谷氨酸特異性受體[32]，繼而造成耳蝸傳入神經(jīng)Ca2+超載，產(chǎn)生胞內(nèi)滲透壓失衡以及興奮性毒性[33]，引起突觸后神經(jīng)纖維腫脹，甚至變性、凋亡[34]。內(nèi)毛細(xì)胞損傷后，谷氨酸的釋放減少，缺乏營養(yǎng)支持，又會(huì)引起突觸后膜的退行性改變。Zheng,X Y等[35]發(fā)現(xiàn)經(jīng)一種谷氨酸的類似物Kainic Acid(KA)干預(yù)后，同樣可以誘導(dǎo)產(chǎn)生耳蝸的興奮性毒性，低濃度的KA可造成耳蝸傳入神經(jīng)元部分可逆性損傷，此時(shí)部分興奮毒性損傷的耳蝸傳入神經(jīng)元可與IHCs建立新的突觸連接[36]，超過一定水平的KA會(huì)引發(fā)不可逆的漸進(jìn)性神經(jīng)退行性變[37]。有作者提出當(dāng)突觸間隙谷氨酸堆積，將過度激活突觸后膜上的谷氨酸受體，導(dǎo)致高閾值聽神經(jīng)纖維末梢發(fā)生永久性損壞[25]，但是大量噪聲導(dǎo)致暫時(shí)性閾移(TTS)的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，突觸后膜因過量谷氨酸鹽釋放被暫時(shí)破壞后，新的突觸后膜可以重新生長并與內(nèi)毛細(xì)胞重新恢復(fù)突觸聯(lián)系從而使聽覺功能得到恢復(fù)。

Lin,Harrison W等[27]將豚鼠在106dB SPL白噪聲下暴露2小時(shí)后，2-24小時(shí)內(nèi)測得ABR閾值偏移40-50dB，但在1-2周內(nèi)ABR閾值可完全恢復(fù)，并通過對突觸帶和突觸后致密物（PSDs）的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)：突觸帶與PSDs的計(jì)數(shù)變化相平行，在噪聲暴露后，其數(shù)量均減少，在1月內(nèi)可部分恢復(fù)，其中有10%的損傷是不可逆的。研究發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后會(huì)出現(xiàn)突觸帶與PSDs不配對的現(xiàn)象，剛修復(fù)的帶狀體在IHC靠近細(xì)胞核的較高部位，體積也相對增大，而幸存的PSDs卻保持在底部位置，隨后帶狀體似乎由于突觸后結(jié)構(gòu)的吸引逐漸向IHC底部移動(dòng)，并重建突觸聯(lián)系[27，38]。石麗娟等[38]將豚鼠在105dB SPL白噪聲下暴露2小時(shí)發(fā)現(xiàn)，ABR閾值可有一過性升高，初期突觸數(shù)量明顯下降，但隨著時(shí)間的延長，突觸的數(shù)量可有不同程度的恢復(fù)，與此相對應(yīng)，CAP幅度先下降，后期不完全恢復(fù)，這提示中-低強(qiáng)度噪聲能導(dǎo)致帶狀突觸的永久性損傷，但隨著時(shí)間的推移部分突觸可以自行修復(fù)，由于殘存或修復(fù)的突觸存在功能缺陷，從而影響其對聲音的編碼能力。宋峰等[39]將豚鼠暴露在95dB SPL白噪聲下4小時(shí)，連續(xù)暴露7天后形態(tài)學(xué)觀察顯示：突觸數(shù)量減少主要分布在距基底膜頂端60-80%區(qū)域，對應(yīng)頻率范圍為5-20kHz，這與聽閾改變的頻率相對應(yīng)。此研究同時(shí)也顯示噪聲暴露后突觸前帶狀體、突觸后致密物及其匹配的突觸數(shù)量的恢復(fù)情況不一致，且突觸前損傷重于突觸后受損，在之后的修復(fù)過程中，近蝸軸側(cè)的突觸前結(jié)構(gòu)更趨集中，同時(shí)配對的突觸數(shù)量增多。楊樂等[8]將小鼠長時(shí)程暴露于噪聲中(70dB SPL，8h/天)，暴露3個(gè)月后表現(xiàn)為全頻不同程度的聽力減退，ABR的I波幅值明顯降低，其中以聽覺頻譜的中間頻率（8-16kHz）受累顯著，突觸的減少也以耳蝸中間區(qū)域?yàn)樯?。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)urman AC等[40]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過106dB SPL白噪聲暴露2小時(shí)后的豚鼠，2周后ABR和DPOAE閾值完全恢復(fù)正常，但內(nèi)毛細(xì)胞上有多達(dá)30%的聽神經(jīng)突觸缺失，暴露后動(dòng)物在高頻(32kHz)區(qū)域的聽神經(jīng)末梢的病理改變也難以完全恢復(fù)，表明噪聲對聽神經(jīng)纖維損傷具有空間選擇性，進(jìn)一步研究人員推測這種損傷的選擇性可能與噪聲誘導(dǎo)所致隱匿性聽力損失患者在嘈雜環(huán)境中的言語識(shí)別率下降有關(guān)。

柳柯等[41]發(fā)現(xiàn)將小鼠暴露于較強(qiáng)噪聲后(120dB SPL，2h)，可導(dǎo)致小鼠耳蝸外毛細(xì)胞纖毛受損，并形成永久性閾移，帶狀突觸計(jì)數(shù)明顯下降，但在2周后突觸數(shù)量有少量恢復(fù)，這提示帶狀突觸在強(qiáng)噪聲下仍有自我修復(fù)和保護(hù)機(jī)制。

4 中-低強(qiáng)度噪聲暴露耳蝸帶狀突觸損傷的預(yù)防與治療

從上述研究中我們發(fā)現(xiàn)，中-低強(qiáng)度噪聲可造成可逆性聽覺閾值變化，隨著時(shí)間推移，這種閾值變化可恢復(fù)至初始狀態(tài)。雖然帶狀突觸數(shù)量會(huì)有明顯減少和不完全恢復(fù)，但并不會(huì)導(dǎo)致以聽閾為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)的聽力水平發(fā)生嚴(yán)重?fù)p害。在現(xiàn)代社會(huì)中，由于暴露于低水平噪聲的現(xiàn)象普遍存在，這種損傷在耳蝸的累積可能成為老年人聽覺分辨率降低的機(jī)制之一[42]，也是隨著年齡增長而出現(xiàn)語音感知問題的主要因素。目前預(yù)防中-低強(qiáng)度噪聲暴露聽覺損害最有效方法仍然是物理衰減其進(jìn)入內(nèi)耳。今后在實(shí)踐中，可能需要加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的工作：1）首先需要嚴(yán)格執(zhí)行國家規(guī)定的各類噪聲控制設(shè)計(jì)規(guī)范，落實(shí)噪聲限值和防護(hù)距離標(biāo)準(zhǔn)；2）需加強(qiáng)宣教，在條件允許的情況下使用聽力保護(hù)裝置及設(shè)備，并對噪音源進(jìn)行最大程度的隔離；3）最新研究表明，即使70dB SPL甚至更低強(qiáng)度的噪聲長期暴露依然可以顯著損害聽覺功能，因此需要將最新研究與民眾和城市管理者分享，參考新的研究成果修改或更新城市噪聲防護(hù)策略；4）對于存在聽功能異常但聽覺檢測閾值正常的患者需要進(jìn)行更加全面的聽功能檢測和評(píng)估；5）對于長期中-低強(qiáng)度噪聲暴露并處于隱匿性聽力損失狀態(tài)的患者，恢復(fù)突觸功能的藥物或其它治療方法可能具有實(shí)際效果，但是此類藥物距離實(shí)際應(yīng)用依然任重道遠(yuǎn)，還需要在安全性、有效性等方面進(jìn)行大量的試驗(yàn)工作。