老年性聾小鼠耳蝸帶狀突觸損傷特點(diǎn)及機(jī)制研究

魏薇 楊麗輝 熊偉 柳柯,4 馬秀嵐 龔樹生,4 杜政德*

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科（沈陽110004）

2遼寧省人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（沈陽110016）

3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉科（北京100050）

4北京市臨床醫(yī)學(xué)研究所耳鼻咽喉頭頸外科研究室（北京100050）

老年性聾(Presbycusis)又稱為年齡相關(guān)性聾(Age-Related Hearing Loss,ARHL)，主要表現(xiàn)為雙耳高頻聽力下降的感音神經(jīng)性耳聾，是老年人第三大慢性常見疾病，其中70周歲以上約70%患有ARHL，而80周歲以上增加至80%，目前已經(jīng)嚴(yán)重影響了老年人的生活質(zhì)量[1-3]。因此，ARHL發(fā)病機(jī)制的深入研究，對防治ARHL意義重大。近來，研究發(fā)現(xiàn)耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸在ARHL發(fā)病發(fā)展過程中表現(xiàn)最為敏感，是小鼠耳蝸老化最早發(fā)生損傷的部位[4]。耳蝸帶狀突觸是聽覺傳導(dǎo)系統(tǒng)中將聲音向中樞傳遞的第一個(gè)突觸結(jié)構(gòu)，因其空間分布呈帶狀故稱為帶狀突觸(Ribbon Synapse)，耳蝸帶狀突觸的功能決定了聲音向中樞傳遞的質(zhì)和量[5]。

耳蝸帶狀突觸功能的維持依賴于囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，是一個(gè)高耗能的量子式釋放過程，需要內(nèi)毛細(xì)胞線粒體的持續(xù)供能[6]。而在老化的過程中，線粒體氧化損傷增多，影響三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）的生成[7]，進(jìn)而影響耳蝸帶狀突觸功能，可能是ARHL耳蝸帶狀突觸損傷的病理生理機(jī)制。但在耳蝸老化過程中，耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸各回?fù)p傷的嚴(yán)重程度，及耳蝸帶狀突觸損傷的具體機(jī)制均尚不明確。此外，體內(nèi)活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）生成增多，可激活線粒體解偶聯(lián)蛋白2（Uncoupling Protein 2,Ucp2）生成增多，Ucp2可減少負(fù)反饋調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生，但同時(shí)也減少了ATP的生成[8,9]。然而在老化過程中，Ucp2在耳蝸中的表達(dá)特點(diǎn)尚不清楚。

因此，本研究將利用ABR、免疫組織化學(xué)激光共聚焦顯微鏡成像等技術(shù)，檢測ARHL耳蝸帶狀突觸的數(shù)量變化及Ucp2的表達(dá)，并探討Ucp2在年齡相關(guān)性耳蝸帶狀突觸損傷中的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只1月齡和12月齡雄性C57BL/6J小鼠（各12只）購自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。兩組動(dòng)物均無噪聲暴露史，無其它藥物使用史。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理嚴(yán)格遵守首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定。

1.2 聽功能檢測

小鼠聽功能檢測采用美國TDT測聽設(shè)備，分別檢測1月齡和12月齡C57BL/6J小鼠8kHz，16kHz和32kHz時(shí)的雙耳ABR閾值及Ⅰ波幅值。1月齡和12月齡組小鼠（每組6只）腹腔內(nèi)注射氯胺酮（100 mg/kg）和鹽酸賽拉嗪（10 mg/kg）麻醉，麻醉滿意后，將小鼠移入隔聲屏蔽室內(nèi)，連接電極，記錄電極插入顱頂正中皮下，參考電極插入測試耳耳垂處，接地電極置于對側(cè)耳耳垂，測試電極距離外耳道口0.5cm，測試電阻小于3kΩ，調(diào)整給聲喇叭貼近外耳道而不接觸耳廓。以短純音（Tone burst）作為刺激聲，測試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在8k、16k、32kHz各個(gè)頻率ABR閾值和I波幅值，刺激強(qiáng)度從90dB SPL開始，以10dBL逐漸遞減，以能分辨出可重復(fù)的ABR波Ⅱ的最低刺激強(qiáng)度判斷閾值。

1.3 耳蝸帶狀突觸計(jì)數(shù)

免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸突觸前蛋白Ctbp2，Ctbp2的數(shù)量用于耳蝸帶狀突觸計(jì)數(shù)。頸椎脫臼法處死1月齡組和12月齡組小鼠（每組4只），快速取出耳蝸，放入4%多聚甲醛溶液。在解剖顯微鏡下，用細(xì)針在蝸頂鉆孔，并開放圓窗和卵圓窗，用4%多聚甲醛溶液自蝸頂進(jìn)行灌流，沖出淋巴液，4℃冰箱固定過夜。第二天，將標(biāo)本置于10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣2h后，在解剖顯微鏡下，用顯微鑷去除已脫鈣的耳蝸蝸殼、外側(cè)壁、前庭膜及蓋膜，分離出基底膜。將基底膜置于0.3%Triton X-100+2%BSA（bovine serum albumin，牛血清白蛋白）中破膜和封閉30min，加入小鼠來源的Ctbp2（1：500稀釋，BD Biosciences，美國）和標(biāo)記內(nèi)毛細(xì)胞的Myosin VIIa（1:500稀釋，Abcam，美國）一抗4℃過夜，PBS沖洗3次；加入合適的二抗，37℃避光染色1h，PBS沖洗3次（5min/次），含DAPI（標(biāo)記細(xì)胞核）的封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡掃描和計(jì)數(shù)，激光共聚焦顯微鏡設(shè)定的掃描層距為0.35μm。

1.4 耳蝸Ucp2蛋白的檢測

1月齡組和12月齡組小鼠（每組4只）頸椎脫臼處死后，快速取出雙側(cè)耳蝸，放入裝有RIPA裂解液（碧云天，中國）中，于冰上研磨耳蝸組織，4℃12000rpm/min離心25min提取總蛋白，取上清并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品上樣于SDS-PAGE凝膠不同泳道的電泳孔中，用電壓80V跑過濃縮膠后轉(zhuǎn)換電壓至120V，待溴酚藍(lán)位于凝膠底邊，改用恒流200mA將目的蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜上，然后用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液室溫下封閉2小時(shí)，再加入一抗anti-Ucp2（1:500稀釋，Abcam，美國）、anti-GAPDH（1:1000,CST,美國），4℃過夜。第二天，用TBST緩沖液洗膜3次（5min/次），加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000,中杉金橋，中國），室溫下?lián)u床孵育1小時(shí)，再次用TBST緩沖液洗膜3次（5min/次）。在暗室內(nèi)使用ECL發(fā)光液A,B（碧云天，中國）按1:1比例混合，加至PVDF膜上，放入暗盒內(nèi)，壓片曝光。對曝光好的膠片進(jìn)行固定、掃描和保存，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics,Inc.,美國）進(jìn)行半定量分析，以GAPDH為內(nèi)參照物。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0（SPSS Inc.,美國）統(tǒng)計(jì)軟件行兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 12月齡C57BL/6J小鼠聽功能損傷特點(diǎn)

1月齡C57BL/6J小鼠在8 kHz、16 kHz和32 kHz的ABR閾值分別為22.50±6.45 dB SPL、28.75±4.79 dB SPL和61.25±4.79 dB SPL；12月齡C57BL/6J小鼠在8kHz的ABR閾值為72±5.70 dB SPL，比1月齡小鼠明顯升高（t=12.226,P＜0.01），見表1，在16kHz和32kHz ABR閾值大于90dB SPL（圖1C）；1月齡組和12月齡組小鼠8kHz的ABR閾值波形圖見圖1A、B；12月齡小鼠90dB SPL聲場強(qiáng)度下的8kHz的 ABR I波幅值為0.54±0.14μV，1月齡組小鼠 8kHz、16kHz、32kHz在 90dB SPL 聲場強(qiáng)度下8kHz、16kHz、32kHz的ABR I波幅值分別為0.95±0.09μV、0.72±0.30μV、0.39±0.25μV（圖1D），12月齡組小鼠與1月齡組相比，在90dB SPL聲場強(qiáng)度下8kHz的ABR I波幅值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.102,P＜0.01）。

表1 1月齡組和12月齡組C57BL/6J小鼠聽力閾值變化(x±s)(dB SPL)Table 1 The alterations of hearing threshold betwen 1-Month and 12-Month group(x±s)(dB SPL)

圖11 月齡和12月齡C57BL/6J小鼠聽功能（A/B）1月齡組和12月齡組小鼠8kHz的ABR波形圖；（C）1月齡組和12月齡組在8kHz、16kHz、32kHz的ABR閾值；（D）1月齡組和12月齡組小鼠在90dB SPL聲場強(qiáng)度下ABR I波幅值(**P＜0.01)。Fig.1The ABR waveform and threshold,ABR waveⅠamplitude testing in the condition of 90 dB SPL.(A/B)ABR threshold waveform at 8kHz of 12-month and 1-month group；（C）The ABR threshold of 8kHz,16kHz and 32kHz of 12-month and 1-month group;(D)ABR WaveⅠAmplitude in the condition of 90dB SPL between 12-month and 1-months group(**P＜0.01).

2.2 12月齡組小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量下降

1月齡組和12月齡組小鼠耳蝸基底膜鋪片，用特異性標(biāo)記耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸前抗體Ctbp2檢測發(fā)現(xiàn)：1月齡組小鼠耳蝸頂中底回平均每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量分別為14.6±1.14、17.2±2.16、15.8±1.64；12月齡組小鼠耳蝸頂中底回平均每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量分別為7.0±1.0、10.6±3.78、3.8±0.83（圖2），12月齡小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量與1月齡組相比各回均顯著減少，其中底回減少最明顯（t=17.076,P＜0.01），其次是頂回（t=10.230,P＜0.01）和中回（t=3.386,P＜0.05）。

圖21 月齡和12月齡C57BL/6J小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量（A）耳蝸基底膜鋪片Ctbp2（紅色）標(biāo)記耳蝸帶狀突觸突觸前，Myosin VIIa（綠色）標(biāo)記內(nèi)毛細(xì)胞（IHCs）和外毛細(xì)胞（OHCs）細(xì)胞漿，DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記IHCs和OHCs細(xì)胞核；（B）定量分析平均每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量(*P＜0.05,**P＜0.01)。Fig.2 Cochlear basal membrane in confocal microscope and quantitative analysis of the ribbon synapse number.(A)Representative images showing the quantity and localization of Ctbp2(red)protein of cochlear ribbon pre-synapse in the cochlear basal membrane;Myosin VIIa(Green)indicating the cytoplasm of inner hair cells(IHC)and out hair cells(OHC);DAPI(blue)indicating the nucleolus of IHCs and OHCs.(B)Analysis the number of ribbon synapse for per inner hair cell.(*P＜0.05,**P＜0.01)Scale bar：10μm

2.3 12月齡組小鼠耳蝸Ucp2蛋白水平表達(dá)明顯下降

圖3 1月齡和12月齡C57BL/6J小鼠耳蝸線粒體Ucp2的表達(dá)（A）Western blot檢測1月齡組和12月齡組小鼠耳蝸Ucp2蛋白的表達(dá)；（B）定量分析兩組Ucp2蛋白水平的表達(dá)差異(**P＜0.01)。Fig.3 The protein expression of mitochondrial Ucp2 in cochlea.(A)Representative image showing the protein expres-sion of Ucp2 in the cochlea of different groups using Western Blot between 12-month group and control group;(B)Quantification of the Ucp2 protein expression in the cochlea between 12-month group and control group(**P＜0.01).

為定量分析ARHL衰老小鼠Ucp2蛋白表達(dá)，我們利用Wstern Blot技術(shù)檢測了兩組小鼠耳蝸線粒體Ucp2蛋白表達(dá)（圖3A）。結(jié)果顯示12月齡組小鼠耳蝸Ucp2蛋白水平是1月齡組的4.58±0.49倍（圖3B），12月齡耳蝸Ucp2比1月齡組顯著升高（t=11.429,P＜0.01）。

3 討論

C57BL/6J小鼠耳蝸毛細(xì)胞從成年期開始出現(xiàn)退變，12月齡時(shí)開始出現(xiàn)顯著的聽力損失及耳蝸退行性改變，是目前最理想的ARHL動(dòng)物模型之一[10-12]。耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸在聽覺形成和聽力損失的過程中意義重大，它是將聲音從外周向中樞傳遞的第一個(gè)傳入性突觸結(jié)構(gòu)，是聲音信號從外周向中樞傳遞的重要節(jié)點(diǎn)，任何因素如老化、噪聲及耳毒性藥物等都會(huì)引起帶狀突觸數(shù)量、形態(tài)及功能的改變，進(jìn)而影響聲音傳遞的質(zhì)量。李曉瑞等[13]發(fā)現(xiàn)與2月齡小鼠相比，6月齡小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量減少主要發(fā)生在底回，10月齡小鼠帶狀突觸數(shù)量在各回均明顯減少，而12月齡小鼠頂、中回繼續(xù)減少，底回反而稍微增多。Rui等[14]發(fā)現(xiàn)FBN大鼠在20月齡時(shí)帶狀突觸數(shù)量開始減少，在第24、28個(gè)月齡時(shí)，4kHz基底膜區(qū)域（底回）突觸數(shù)量顯著減少，12kHz、24kHz基底膜區(qū)域（中回、頂回）突觸數(shù)量無顯著變化。而在105dB、8-16kHz、60min噪聲暴露下，F(xiàn)VB/nJ小鼠在12kHz和24kHz區(qū)域(中、頂回)中的突觸數(shù)量均減少，其中頂回減少更顯著[15]。此外，Ke等[16]研究證實(shí)在耳毒性藥物作用下，C57BL/6J小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量底回減少最明顯，其次是中回、頂回?？傊?，目前耳蝸各回帶狀突觸損傷嚴(yán)重程度尚存在很大爭議，而本研究證實(shí)相對于1月齡組，12月齡組老年性C57BL/6J小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量損傷底回最為嚴(yán)重，其次是頂回和中回。

耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸在聽覺系統(tǒng)發(fā)揮功能主要依賴于突觸前膜囊泡精準(zhǔn)地轉(zhuǎn)運(yùn)、聚集以及釋放[6]，這個(gè)過程需要耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞線粒體產(chǎn)生大量ATP供能，因此突觸功能的維持需要線粒體的持續(xù)供能[17-19]。ABR I波幅值可反映耳蝸帶狀突觸的功能，在本研究中12月齡組在90dB SPL聲強(qiáng)強(qiáng)度下的I波幅值顯著低于1月齡對照組，與以往研究結(jié)果相一致[20]，提示很可能是線粒體能量代謝紊亂，導(dǎo)致耳蝸帶狀突觸功能下降，進(jìn)一步誘發(fā)ARHL的發(fā)生與發(fā)展。

ARHL是一種機(jī)體退行性病變的慢性過程，老化機(jī)制十分復(fù)雜，目前研究證實(shí)線粒體功能紊亂及氧化應(yīng)激損害與ARHL關(guān)系最為密切[21,22]。而解偶聯(lián)蛋白（Uncoupling proteins,Ucps）是一類位于線粒體內(nèi)膜上參與質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白家族，在ROS生成增多的情況下，可限制ATP的合成，并參與丙酮酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終將能量以熱形式消耗進(jìn)而調(diào)控能量代謝[23]。Ucp2在Ucps家族成員中分布最廣，主要通過發(fā)揮“質(zhì)子漏”的功能，即降低線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子梯度，減少ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕了氧化應(yīng)激反應(yīng)，但同時(shí)也降低了ATP的產(chǎn)生[24]。在本研究中，我們通過Western Blot發(fā)現(xiàn)12月齡組小鼠耳蝸Ucp2的表達(dá)量明顯增多，顯著高于1月齡組。因此，我們推測在ARHL過程中，耳蝸內(nèi)氧化應(yīng)激ROS損傷增加，啟動(dòng)Ucp2保護(hù)機(jī)制減少了ATP的合成，從而誘發(fā)ARHL耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸的損傷。因此，本研究結(jié)果為以后的ARHL耳蝸帶狀突觸損傷的機(jī)制研究提供了新的思路。

綜上所述，在ARHL發(fā)生發(fā)展過程中，早期可出現(xiàn)線粒體功能紊亂與耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸損傷，其中耳蝸底回帶狀突觸損傷最明顯，其次是中回及頂回。此外，本研究中Ucp2在12月齡老年鼠耳蝸中表達(dá)量明顯增高，推測Ucp2可能通過降低線粒體ATP合成，進(jìn)而影響耳蝸帶狀突觸正常功能的維持，最終導(dǎo)致ARHL耳蝸帶狀突觸功能的降低和數(shù)量的下降，本研究的發(fā)現(xiàn)將有望在未來老年性聾的防治過程中發(fā)揮重要作用。