100dB SPL白噪聲暴露對(duì)小鼠耳蝸聽神經(jīng)髓鞘的影響

郭曉安 柯朝陽 柳柯 魏薇 施磊*

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（沈陽110001）

2暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（深圳市人民醫(yī)院）耳鼻咽喉科（深圳518020）

3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100050）

4中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科（沈陽110004）

隨著現(xiàn)代社會(huì)電子信息化的不斷進(jìn)步，手機(jī)、電腦以及汽車高鐵等產(chǎn)生的噪聲與人們的生活聯(lián)系日益密切。暴露在此類噪聲環(huán)境下的人群聽力健康情況也開始受到了醫(yī)生和科研人員的關(guān)注。噪聲性聾是一種常見的感音神經(jīng)性聾，通常是由于暴露于有害強(qiáng)度的噪聲環(huán)境下而出現(xiàn)聽覺敏感度及分辨力的下降，甚至聽閾的升高。當(dāng)這種聽閾的改變呈一過性，在脫離噪聲環(huán)境后恢復(fù)到正常水平，稱為暫時(shí)性閾移（temporary threshold shift，TTS）[1-2]。但聽神經(jīng)功能的損傷并不一定能隨著暫時(shí)性閾移的恢復(fù)而得到恢復(fù)，對(duì)此已有最新研究表明[3]，在有些情況下噪聲暴露后聽閾并不能完全恢復(fù)到暴露前水平，則稱之為永久性閾移（PTS）。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)一般認(rèn)為只有永久性閾移聽功能才受到損害，暫時(shí)性閾移對(duì)聽功能的損害并不顯著。近些年的研究表明，中等強(qiáng)度噪聲暴露后盡管ABR閾值可以恢復(fù)到暴露前水平，然而ABR I波的幅值卻不能完全恢復(fù)；進(jìn)一步，對(duì)受暴露動(dòng)物或患者的聽力學(xué)檢測顯示，其CAP幅值也是降低且不能恢復(fù)的。目前這種噪聲暴露后聽功能檢測的異常情況稱為噪聲誘導(dǎo)的隱匿性聽力損失（hidden hearing loss,HHL）[4-5]。對(duì)于隱匿性聽力損失的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)耳蝸帶狀突觸的數(shù)量減少了，即使在聽力閾值完全恢復(fù)的情況下，小鼠帶狀突觸標(biāo)記物數(shù)量也僅有暴露前50%左右[5]，表明耳蝸帶狀突觸損傷可能是隱匿性聽力損失的發(fā)病機(jī)制。這種發(fā)病機(jī)制的闡明，很好的解釋了隱匿性聽力損失患者的一些特征，比如噪聲背景下言語識(shí)別率下降、老年性聾出現(xiàn)時(shí)間提前，程度加重等等聽功能異常現(xiàn)象。

然而最新的研究表明聽神經(jīng)暫時(shí)性脫髓鞘改變可能是小鼠隱匿性聽力損失發(fā)生的主要發(fā)生機(jī)制[6]。我們知道聽神經(jīng)纖維屬于有髓神經(jīng)纖維，內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元（spiral ganglion neuron，SGN）軸突與內(nèi)毛細(xì)胞形成突觸連接，表面由施旺細(xì)胞（schwann cell，SC）包繞形成髓鞘結(jié)構(gòu)，兩個(gè)相鄰的施旺細(xì)胞之間的無髓鞘部分形成特殊的郎氏結(jié)（nodes of ranvier）結(jié)構(gòu)，其能使興奮呈跳躍式傳導(dǎo)，有效地加快傳導(dǎo)速度，是有髓神經(jīng)纖維重要的傳導(dǎo)方式。而當(dāng)髓鞘出現(xiàn)厚度變薄、板層破壞、與軸突分離及髓鞘空泡樣改變等脫髓鞘改變時(shí)，均可導(dǎo)致神經(jīng)信息傳導(dǎo)速度下降，聲音信號(hào)編碼同步性的紊亂的情況發(fā)生。Wan G[6]等人研究證明，將小鼠暴露于8～16 kHz，98 dB SPL噪聲中2小時(shí)，能造成小鼠噪聲性隱匿性聽力損失。然而在隱匿性聽力損失情況下是否確實(shí)發(fā)生了暫時(shí)性脫髓鞘改變呢？目前本研究領(lǐng)域尚無定論。為此我們擬通過本研究來證實(shí)噪聲誘導(dǎo)隱匿性聽力損失條件下是否發(fā)生了聽神經(jīng)脫髓鞘改變。為此我們采用聽功能正常的6周齡成年C57BL/6J小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用100dB SPL寬頻帶白噪聲對(duì)小鼠進(jìn)行單次2小時(shí)暴露，以誘導(dǎo)小鼠發(fā)生隱匿性聽力損失改變，并在此條件下觀察受試動(dòng)物耳蝸聽神經(jīng)是否出現(xiàn)脫髓鞘改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選取符合SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的6周齡雄性C57BL/6J小鼠（由北京維通利華公司提供）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并于實(shí)驗(yàn)前篩選ABR聽閾正常小鼠入組，共計(jì)24只。將小鼠隨機(jī)分成3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組6只小鼠（共計(jì)12個(gè)耳蝸，基底膜鋪片、冰凍切片、透射電鏡三種實(shí)驗(yàn)方法每項(xiàng)各4個(gè)耳蝸）。實(shí)驗(yàn)組分為：P0（噪聲暴露后即刻）、P7（噪聲暴露后7天）及P14（噪聲暴露后14天），對(duì)照組采用未接受噪聲暴露處理的同鼠齡、同批次小鼠。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)操作均按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)定進(jìn)行。

1.2 噪聲暴露

噪聲暴露前為確保揚(yáng)聲器工作期間的聲強(qiáng)變化1dB，先使用標(biāo)準(zhǔn)聲級(jí)計(jì)（AWA5636型，測量指標(biāo)LFp dBA，北京宏昌信科技有限公司）對(duì)聲音進(jìn)行校準(zhǔn)，使鼠籠中的聲音強(qiáng)度符合標(biāo)準(zhǔn)。隨后將小鼠置于鼠籠（尺寸約為4cm×4cm×16cm大?。┲?，放置于揚(yáng)聲器的正下方。采用100dB聲壓級(jí)（SPL）的寬頻帶白噪聲進(jìn)行暴露，持續(xù)2小時(shí)。

1.3 ABR檢測

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用美國TDT測聽模塊設(shè)備，biosig測聽軟件系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行ABR檢測。測聽過程在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，檢測前使用10%水合氯醛（0.0045ml～0.005ml/g，腹腔注射）對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉。麻醉滿意后，將記錄電極置于小鼠雙側(cè)耳廓前緣連線中點(diǎn)皮下，參考電極置于測試耳耳后皮下，接地電極置于對(duì)側(cè)耳耳后皮下，測試耳機(jī)距外耳道口約0.5cm，檢測小鼠雙耳的ABR閾值。實(shí)驗(yàn)采用短聲（Click）和短純音（Toneburst，Rise/Fall time:1 msec；Duration:4 msec）作為刺激聲，帶通濾波為300～3000Hz，疊加次數(shù)為 1024 次，掃描時(shí) 間10ms。刺激強(qiáng)度自90dB SPL開始，以10dB逐漸遞減，直至檢測不出重復(fù)的ABR波形，再向上增強(qiáng)5dB，直至能檢測出重復(fù)的ABR波形，此刺激聲強(qiáng)度即為小鼠的聽閾。

1.4 耳蝸基底膜取材及免疫組化標(biāo)記

測聽結(jié)束后以頸椎脫臼法處死小鼠，眼科剪迅速斷頭，去除腦組織，快速分離顳骨與耳蝸，去除蝸殼，將耳蝸放入裝有4%多聚甲醛溶液的培養(yǎng)皿中。在解剖顯微鏡下，用細(xì)鑷在蝸頂鉆孔，并開放圓窗和卵圓窗。將4%多聚甲醛溶液自蝸頂進(jìn)行灌流，沖出淋巴液，灌流完成后繼續(xù)置于4%多聚甲醛溶液中固定，4℃冰箱過夜。次日取出標(biāo)本置于10%EDTA溶液中脫鈣3小時(shí)，將已脫鈣的耳蝸標(biāo)本放入PBS溶液培養(yǎng)皿中，緩慢剝?nèi)ボ浕奈仛?，切除螺旋韌帶，并去除前庭膜及蓋膜，分離蝸軸和基底膜。

將分離好的基底膜置于配制好的Triton100-X打孔30分鐘，含PBS緩沖液的5%山羊血清封閉1小時(shí)。漂洗充分后加入一抗（大鼠來源MBP，1:200，Millipore；雞來源 NF200，1:600，Chemicon）后4℃孵育過夜，次日用PBS清洗3次，每次5-10分鐘，再加入二抗（羊抗大鼠488抗體，1:300，Invitrogen，用以標(biāo)記一抗MBP；羊抗雞594抗體，1:300，Invitrogen，用以標(biāo)記一抗NF200)室溫避光孵育2小時(shí)，隨后清洗3次，每次5-10分鐘。最后在載玻片上滴加一滴（約40ul）免洗DAPI液，解剖顯微鏡下鋪片后，將蓋玻片倒扣于載玻片上避光保存。

1.5 耳蝸冰凍切片標(biāo)本制備及免疫組化標(biāo)記

ABR檢測后處死動(dòng)物，快速分離出耳蝸，去除蝸殼，將耳蝸放入有4%多聚甲醛溶液的培養(yǎng)皿中，于蝸頂鉆孔、開放圓窗和卵圓窗進(jìn)行灌流，完成后放入4%多聚甲醛溶液中固定，4℃冰箱過夜。次日將耳蝸用置入10%EDTA脫鈣液中脫鈣，室溫條件下12小時(shí)。其后用PBS溶液洗脫3次，在解剖顯微鏡下修剪標(biāo)本，置于20%蔗糖溶液中脫水，室溫放置2小時(shí)。取出耳蝸，再置入OCT包埋劑中浸泡，室溫下浸膠2小時(shí)。浸膠完成后放于冰凍切片機(jī)（LEIv CA CM1950）中切片，操作溫度需于-20℃以下，設(shè)置片厚為10um。切片完成后，在烤箱（60℃）中烤片20分鐘。

PBS溶液將烤制好的切片清洗5分鐘，用含0.3%TritonX-100的PBS浸泡30分鐘，隨后用含10%羊血清+1%BSA的PBS封閉1小時(shí)。置于一抗（大鼠來源MBP，1:200，Millipore；雞來源NF200，1:600，Chemicon）中4℃孵育過夜。次日經(jīng)PBS清洗后，加入二抗（羊抗大鼠488抗體，1:300，Invitrogen；羊抗雞594抗體，1:300，Invitrogen）溶液，室溫避光孵育2小時(shí)。PBS清洗后滴加免洗DAPI液后，封片避光保存。

1.6 激光共聚焦顯微鏡成像

將耳蝸基底膜鋪片置于Leica正置共聚焦顯微鏡（TCS SP5 II;Leica Microsystems,Wetzlar,Germany）63×油鏡下觀察，選擇激發(fā)光波長為405nm、488nm以及594nm對(duì)標(biāo)本進(jìn)行層掃，熒光激發(fā)下分別顯示藍(lán)色、綠色和紅色，設(shè)置掃描層距為0.35um/層。以熒光信號(hào)出現(xiàn)時(shí)開始層掃，以信號(hào)消失時(shí)結(jié)束，將所有層掃圖片疊加后形成最終的結(jié)果圖片。

1.7 透射電子顯微鏡標(biāo)本制備及成像

處死小鼠后快速將耳蝸剝出并放入2.5%戊二醛溶液中進(jìn)行灌流，沖出淋巴液后置于2.5%戊二醛溶液中固定，4℃冰箱過夜。次日10%EDTA溶液脫鈣后剝?nèi)ボ浕奈仛?，分離出基底膜，并去除前庭膜及蓋膜。將標(biāo)本經(jīng)梯度酒精脫水，再置于100%丙酮與EPON 812 1:1混合液中浸透40分鐘。包埋劑加DMP-30浸透12小時(shí)。將包埋劑注入平板包埋模內(nèi)，再把基底膜組織按切片要求放進(jìn)包埋板內(nèi)。將包埋好的組織塊放入干燥器中，烤箱35℃聚合12小時(shí)，45℃聚合12小時(shí)，60℃聚合24小時(shí)。之后將組織暴露，修成梯形，切半薄切片，染色定位。醋酸雙氧鈾飽和液染色30分鐘，檸檬酸鉛染色10～15分鐘。最后在透射電子顯微鏡（JEM-1400plus,Japan）下觀察髓鞘形態(tài)變化情況。

1.8 透射電鏡聽神經(jīng)髓鞘直徑計(jì)數(shù)

本研究采用Image J software(SummaSketch III Summagraphics，Seattle，WA)測量神經(jīng)纖維軸突和總神經(jīng)纖維（軸突＋髓鞘）直徑。本研究按照先前研究方法[7]測量有髓神經(jīng)纖維直徑包括確定神經(jīng)纖維斷面最長軸，其直徑為與最長軸相垂直的神經(jīng)纖維橫徑中最長橫徑，并計(jì)算出g-ratio值（=神經(jīng)纖維軸突直徑/總神經(jīng)纖維的直徑）；g-ratio值越大，表明髓鞘越薄，反之表明髓鞘變厚。計(jì)數(shù)時(shí)分別以3個(gè)神經(jīng)纖維為1個(gè)計(jì)數(shù)矩形視野，分別計(jì)算出視野中3個(gè)g-ratio值，除以3得到每個(gè)聽神經(jīng)纖維的平均g-ratio值，每個(gè)耳蝸標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，共計(jì)4個(gè)標(biāo)本（20個(gè)視野），最后統(tǒng)計(jì)出每組小鼠g-ratio值（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

資料分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)照組與噪聲暴露后各組ABR閾值總體比較采用單因素方差分析，各組組間比較應(yīng)用Dunnet或LSD法檢驗(yàn)。聽神經(jīng)髓鞘g-ratio值計(jì)數(shù)結(jié)果也采用單因素方差分析，比較各時(shí)間點(diǎn)與未暴露組的差別，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 100dB SPL白噪聲暴露2小時(shí)對(duì)小鼠ABR聽閾的影響

C57BL/6J小鼠在噪聲暴露前，其各個(gè)頻率的聽力閾值分別為：Click（16.7±2.6dB）、4kHz（34.2±3.8dB）、8kHz（23.3±2.6dB）、16kHz（25.8±3.8dB）和32kHz（55.0±7.1dB）。100dB白噪聲條件下暴露2小時(shí)后即刻（P0），測得Click（23.3±4.1dB）（F=3.58，P=0.01）和 4kHz（39.2±3.8dB）（F=2.71，P=0.02）頻率的聽力閾值較暴露前明顯差異（P＜0.05），而在8kHz（30.8±3.8dB）（F=5.05，P=0.002）、16kHz（38.3±5.2dB）（F=10.43，P=0.000）、32kHz（72.5 ± 6.9dB）（F=10.48，P=0.000）處閾值升高更為顯著（P＜0.01）。暴露后 7天（P7），Click（18.3±4.1dB）（F=3.58，P=0.49）、4kHz（35.8 ± 3.8dB）（F=2.71，P=0.39）、8kHz（25.0±4.5dB）（F=5.05，P=0.45）、16kHz（30.0±4.5dB）（F=10.43，P=0.89）處閾值已逐漸恢復(fù)到暴露前水平（P＞0.05），僅高頻 32kHz（63.3±4.1dB）（F=10.48，P=0.02）處閾移有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。暴露后14天（P14），觀察到各頻率聽閾水平均已恢復(fù)至暴露前水平（P＞0.05），表明100dB SPL白噪聲暴露2小時(shí)導(dǎo)致C57小鼠出現(xiàn)暫時(shí)性閾移（圖1）。

圖1 100dB白噪聲暴露后C57小鼠ABR閾值變化Fig.1 The Alterations of ABR Threshold of C57BL/6J Mice Exposed to White Noise at 100dB SPL

2.2 100dB SPL白噪聲暴露對(duì)小鼠聽神經(jīng)髓鞘影響的免疫熒光觀察

應(yīng)用髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）對(duì)聽神經(jīng)髓鞘進(jìn)行標(biāo)記，我們觀察耳蝸基底膜共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，C57BL/6J小鼠在100dB寬頻帶白噪聲暴露后，聽神經(jīng)髓鞘各時(shí)間均無明顯缺失及斷裂、排列均勻一致，整體上形態(tài)未受明顯影響（圖2）。而觀察冰凍切片染色可見，相比于對(duì)照組，聽神經(jīng)髓鞘各時(shí)間點(diǎn)均排列整齊、結(jié)構(gòu)典型，纖維數(shù)量及信號(hào)強(qiáng)度亦無明顯差異（圖3）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明100dB寬頻帶白噪聲暴露2小時(shí)可能并未明顯損害C57小鼠聽神經(jīng)髓鞘的形態(tài)結(jié)構(gòu)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論，我們下一步將對(duì)小鼠聽神經(jīng)髓鞘的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

圖2 基底膜鋪片染色觀察噪聲暴露對(duì)耳蝸聽神經(jīng)髓鞘的影響（頂回）Fig.2 Observe the Effect of Auditory Nerve Myelin sheath after Noise Exposure Cochlear Basal Membrane Staining(Apical Turn)

圖3 冰凍切片染色觀察噪聲暴露后小鼠耳蝸聽神經(jīng)髓鞘的變化（頂回）Fig.3 Observe the alterations of auditory nerve myelin sheath using Frozen Sections of Cochlea Staining(Apical Turn)

2.3 100dB SPL白噪聲暴露對(duì)小鼠聽神經(jīng)髓鞘影超微結(jié)構(gòu)影響

本研究采用透射電鏡對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠的聽神經(jīng)髓鞘進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠聽神經(jīng)髓鞘在透射電鏡下大部分都呈同心圓狀、板層樣結(jié)構(gòu)，且板層均勻致密，邊緣光滑完整（圖4A-B）。接下來，我們經(jīng)過計(jì)算得到其髓鞘g-ratio值分別為0.62±0.08（Control）、0.61±0.09（P0）、0.65±0.08（P7）及0.66±0.05（P14），各組間g-ratio值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，驗(yàn)證了噪聲暴露前后神經(jīng)髓鞘厚度無明顯變化（F=0.393，P＞0.05）（圖4C），本結(jié)果表明髓鞘在中等強(qiáng)度白噪聲暴露2小時(shí)后形態(tài)上并無顯著改變，不足以表明聽神經(jīng)出現(xiàn)明顯的脫髓鞘現(xiàn)象。

圖4 透射電鏡觀察噪聲暴露對(duì)小鼠耳蝸聽神經(jīng)髓鞘的影響（頂回）Fig.4 Observe the alterations of auditory nerve myelin sheath using Transmission Electron Microscopy(Apical Turn).

3 討論

噪聲性聾是一種由于長期暴露于損害性噪聲環(huán)境下出現(xiàn)的感音性聾，早期多表現(xiàn)為一過性聽閾升高，而往往在脫離噪聲環(huán)境后可逐漸恢復(fù)，稱暫時(shí)性閾移。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)6周齡雄性C57BL/6J小鼠進(jìn)行100dB寬頻帶白噪聲暴露2小時(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后即刻，小鼠各頻率的閾移即為最大值，且以高頻處的聽力損失最為嚴(yán)重（10～20dB左右），而在噪聲暴露后第14天小鼠各頻率ABR閾值則完全恢復(fù)，再次驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果[7-9]。

在此條件下，我們依據(jù)先前實(shí)驗(yàn)方法對(duì)本研究中小鼠聽神經(jīng)髓鞘的變化情況進(jìn)行觀察分析[10]。通過對(duì)約占髓鞘蛋白1/3且具有神經(jīng)特異性的髓鞘堿性蛋白（MBP）進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)小鼠聽神經(jīng)髓鞘在暴露即刻以及其后的兩周之內(nèi)均未發(fā)生明顯的損傷，形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著變化。再經(jīng)透射電鏡統(tǒng)計(jì)各時(shí)間點(diǎn)的髓鞘g-ratio值（神經(jīng)軸突直徑/總神經(jīng)纖維直徑），也再次證明在中等強(qiáng)度寬頻帶白噪聲暴露2小時(shí)后，小鼠的聽神經(jīng)髓鞘并不能影響髓鞘的厚度以及造成明顯的脫髓鞘改變。

聽神經(jīng)髓鞘是由施旺細(xì)胞纏繞形成的節(jié)段性結(jié)構(gòu)，能起到絕緣和保護(hù)軸突的作用，并且由兩端的髓鞘節(jié)段末端和之間裸露的軸突構(gòu)成郎氏節(jié)，是軸突信號(hào)實(shí)現(xiàn)跳躍式傳遞的基礎(chǔ)[11-12]。而神經(jīng)纖維的直徑、髓鞘的厚度均可影響神經(jīng)信息的傳導(dǎo)速度，因此脫髓鞘改變可能會(huì)導(dǎo)致信息傳導(dǎo)速度下降，進(jìn)而引起神經(jīng)元協(xié)調(diào)刺激的能力受損[13]。而本研究結(jié)果并不能表明隱性聽力損傷與聽神經(jīng)髓鞘間的關(guān)系，有很多研究證實(shí)，中等強(qiáng)度噪聲暴露后小鼠耳蝸帶狀突觸會(huì)有明顯減少[14,15]，帶狀突觸結(jié)構(gòu)的存在能使聽覺信息由內(nèi)毛細(xì)胞瞬時(shí)、持續(xù)且高保真地傳入相連的聽覺纖維[16]，因此推測其功能障礙或數(shù)量減少是聽力損傷的主要原因。

本實(shí)驗(yàn)通過采用100dB SPL的寬頻帶白噪聲對(duì)小鼠進(jìn)行暴露，并研究了此條件下小鼠聽力損傷及髓鞘形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。為今后進(jìn)一步探討相關(guān)形態(tài)學(xué)變化及病理機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究也同樣存在許多不足之處，如我們沒有進(jìn)行隱匿性聽力損失方面的有效檢測，也尚未對(duì)血清髓鞘蛋白含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，因此本文的結(jié)論存在不確定性，也是我們今后研究的重要課題。