D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠耳蝸帶狀突觸損傷

杜政德 宋青玲 韓曙光 柳柯 龔樹生*

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉科（北京100050）

2中國航天科工集團(tuán)731醫(yī)院耳鼻咽喉科（北京100074）

老年性聾又稱為年齡相關(guān)性聽力損失，是老化在聽覺系統(tǒng)的表現(xiàn)[1]。衰老是一個(gè)長期緩慢的過程，由于無法從人類活體取得聽覺組織標(biāo)本以及個(gè)體基因和環(huán)境等因素的影響，使得老化機(jī)制和抗老化的研究受到很大的限制。因此，研究者建立了許多快速衰老的動物模型，用于研究老化機(jī)制及干預(yù)策略。D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老動物表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的快速減退，線粒體功能紊亂，凋亡發(fā)生增加，這些表現(xiàn)和自然老化現(xiàn)象高度一致，成為一種常用的衰老動物模型，被廣泛用于聽覺及其他系統(tǒng)老化機(jī)制及干預(yù)的研究[2-5]。

在先前的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老動物表現(xiàn)為耳蝸氧化應(yīng)激增加和線粒體DNA損傷加重，伴隨少量血管紋邊緣細(xì)胞凋亡，而無毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的明顯丟失，也不會引起明顯的聽性腦干反應(yīng)（auditory brain response，ABR）閾移，但對耳毒性藥物、高脂飲食以及噪聲等危險(xiǎn)因素敏感性明顯增加[6,7]。近年來，國外文獻(xiàn)報(bào)道耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的帶狀突觸是小鼠耳蝸老化過程中最先出現(xiàn)的損傷部位，早期耳蝸帶狀突觸數(shù)量的減少并不能引起ABR閾值增加，僅表現(xiàn)為ABR I波幅值的降低[8]。雖然，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老動物聽功能損傷和動物自然衰老早期存在相似性，但尚無文獻(xiàn)報(bào)道D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老動物耳蝸帶狀突觸變化的情況。

在本研究中，我們利用D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型，采用免疫組織化學(xué)激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)，觀察耳蝸帶狀突觸的數(shù)量變化，探討衰老過程中導(dǎo)致耳蝸帶狀突觸損傷的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型的構(gòu)建

24只5周齡雄性C57BL/6J小鼠購自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組：①對照組：小鼠頸背部皮下注射同體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)6周；②D-半乳糖組：小鼠頸背部皮下注射1000mg/kg D-半乳糖（sigma，美國），每日1次，連續(xù)6周。所有動物均飼養(yǎng)在室溫約20-22°C左右，12小時(shí)晝夜交替的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。兩組動物均無噪聲暴露史，無其它藥物使用史。所有實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)和研究嚴(yán)格遵守首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理規(guī)定。

1.2 聽功能檢測

小鼠聽功能由ABR檢測。對照組和D-半乳糖組小鼠（每組6只）腹腔內(nèi)注射氯胺酮（100 mg/kg）和鹽酸賽拉嗪（10 mg/kg）麻醉。待充分麻醉后，將其移入隔聲屏蔽室內(nèi)，連接電極，測試參考電極，記錄電極插入顱頂正中骨質(zhì)內(nèi)。測試電阻小于3kΩ。調(diào)整給聲喇叭使之貼近外耳道但不接觸耳廓，以減少誤差。以短純音（Tone burst）作為刺激聲，測試實(shí)驗(yàn)動物在8k、16k、32kHz各個(gè)頻率ABR閾值和90dB SPL聲強(qiáng)刺激下I波幅值。以能分辨出可重復(fù)的ABR波Ⅲ的最低刺激強(qiáng)度判斷閾值。

1.3 耳蝸帶狀突觸計(jì)數(shù)

免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸突觸前蛋白CtBP2，CtBP2的數(shù)量用于耳蝸帶狀突觸計(jì)數(shù)。頸椎脫臼法處死對照組和D-半乳糖組小鼠（每組4只），快速取出耳蝸，放入4%多聚甲醛溶液。在解剖顯微鏡下，用細(xì)針在蝸頂鉆孔，并開放圓窗和卵圓窗。用4%多聚甲醛溶液自蝸頂進(jìn)行灌流，沖出淋巴液，4℃冰箱固定過夜。第二天，將標(biāo)本置于10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣2h后，在解剖顯微鏡下，用顯微鑷去除已脫鈣的耳蝸蝸殼、外側(cè)壁、前庭膜及蓋膜，分離出基底膜。將基底膜置于0.3%Triton X-100+2%BSA（bovine serum albumin，牛血清白蛋白）中破膜和封閉30min，加入小鼠來源的CtBP2（1：500稀釋，BD Biosciences，美國）和標(biāo)記內(nèi)毛細(xì)胞的Myosin VIIa（1:500稀釋，Abcam，美國）一抗4℃過夜，PBS沖洗3次；加入合適的二抗，37℃避光染色1h，PBS沖洗3次，含DAPI（標(biāo)記細(xì)胞核）的封片劑封片激光共聚焦顯微鏡掃描和計(jì)數(shù)。激光共聚焦顯微鏡設(shè)定的掃描層距為0.35μm。

1.4 耳蝸帶狀突觸突觸前CtBP2蛋白的檢測

對照組和D-半乳糖組小鼠（每組4只）頸椎脫臼處死后，快速取出雙側(cè)耳蝸，放入裝有RIPA裂解液（碧云天，中國）中，提取總蛋白，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品上樣于SDS-PAGE凝膠不同泳道的電泳孔中，用電壓80V跑過濃縮膠后轉(zhuǎn)換電壓至120V，待溴酚藍(lán)位于凝膠底邊，改用恒流200mA將目的蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜上，然后用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液室溫下封閉2小時(shí)，再加入一抗anti-CtBP2（1:1000稀釋,BD Biosciences，美國）、anti-GAPDH（1:1000,CST,美國），4℃過夜。第二天，用TBST緩沖液洗膜3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000,中杉金橋，中國），室溫下孵育1小時(shí)，再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次5min。在暗室內(nèi)使用ECL發(fā)光液A,B（碧云天，中國）按1:1比例混合，加至PVDF膜上，放入暗盒內(nèi)，壓片曝光。對曝光好的膠片進(jìn)行固定、掃描和保存，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics,Inc.,美國）進(jìn)行半定量分析。

1.5 耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞線粒體DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基-2-脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG）的檢測

頸椎脫臼法處死對照組和D-半乳糖組小鼠（每組4只），快速取出耳蝸，放入4%多聚甲醛溶液，4℃冰箱固定過夜。第二天，將標(biāo)本置于10%EDTA溶液，4℃冰箱脫鈣3天。經(jīng)30%蔗糖脫水后用OCT包埋，使用冰凍切片機(jī)（Leica，美國）行耳蝸中軸位切片。耳蝸切片置于PBS浸泡10min，去除OCT，用免疫組化筆圍繞組織畫圈，滴加0.3%Triton X-100+2%BSA破膜和封閉30min，加入anti-8-OHdG（1：300稀釋，Abcam，美國）和anti-Myosin VIIa（1:300稀釋，Abcam，美國）一抗4℃過夜，PBS沖洗3次；加入合適的二抗，37℃避光染色1h，PBS沖洗3次，含DAPI的封片劑封片激光共聚焦顯微鏡掃描，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0（SPSS Inc.,美國）統(tǒng)計(jì)軟件行兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠ABR I波幅值降低

在8 kHz、16 kHz和32 kHz頻率，對照組小鼠ABR閾值分別為24.29±1.27 dB SPL、27.50±1.14 dB SPL和60.36±3.03 dB SPL，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠ABR閾值分別為26.07±2.52 dB SPL、32.50±2.91 dB SPL和62.86±5.07 dB SPL（圖1A），兩組小鼠ABR閾值相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-0.632,P＞0.05;t=-1.601,P＞0.05;t=-0.423,P＞0.05）；在90dB SPL聲強(qiáng)刺激下，對照組小鼠ABR I波幅值分別為1.21±0.08 μv、0.92±0.07μv 和0.43±0.04 μv，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠ABR I波幅值分別為0.83±0.09 μv、0.66±0.05μv 和0.24±0.05 μv（圖1B），兩組小鼠ABR I波幅值相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=3.216,P＜0.01;t=2.925,P＜0.01;t=3.116,P＜0.01），D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠ABR I波幅值比對照組小鼠明顯降低。

圖1 對照組和D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠聽功能（A）對照組和D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠ABR閾值；（B）對照組和D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠ABR I波幅值。**P＜0.01。Fig.1 The auditory function in the Control mice and D-galactose-induced aging mice.(A)The threshold of ABR in the Control mice and D-galactose-induced aging mice.(B)The amplitude of ABR I wave in the Control mice and D-galactose-induced aging mice.**P＜0.01.

2.2 D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量下降

對照組和D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸基底膜鋪片顯示耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞（Inner hair cells,IHCs）和外毛細(xì)胞（Outer hair cells,OHCs）無丟失（圖2A），用特異性標(biāo)記耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸突出前的抗體CtBP2檢測（圖2A）發(fā)現(xiàn)：對照組小鼠耳蝸平均每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量為13.63±0.85，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸平均每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量為8.75±1.32（圖2B），D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量比對照組顯著減少（t=6.192,P＜0.01）。

圖2 耳蝸基底膜鋪片計(jì)數(shù)耳蝸帶狀突觸數(shù)量（A）耳蝸基底膜鋪片CtBP2（紅色）標(biāo)記耳蝸帶狀突觸突觸前，Myosin VIIa（綠色）標(biāo)記內(nèi)毛細(xì)胞（IHCs）和外毛細(xì)胞（OHCs）細(xì)胞漿，DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記IHCs和OHCs細(xì)胞核；（B）定量分析平均每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸數(shù)量。**P＜0.01。Fig.2 The number of ribbon synapses counted by cochlear flat-surface preparation in the Control group and D-galactose group.(A)Representative images of IHC ribbon synapses.IHCs stained by myosin VIIa(green),ribbon synapses stained by CtBP2(red),the nuclei stained by DAPI(blue).(B)The number of CtBP2 per IHC in the Control group and D-galactose group.**P＜0.01.

2.3 D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸帶狀突觸突觸前CtBP2蛋白水平表達(dá)明顯下降

為進(jìn)一步定量分析D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸帶狀突觸數(shù)量的變化，我們利用western blot技術(shù)檢測了兩組小鼠耳蝸帶狀突觸突觸前蛋白Ct-BP2的表達(dá)（圖3A）。D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸CtBP2蛋白水平是對照組的0.61±0.04倍（圖3B），D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸CtBP2蛋白水平比對照組顯著降低（t=3.711,P＜0.01）。

圖3 耳蝸帶狀突觸突觸前蛋白CtBP2的表達(dá)（A）western blot檢測對照組和D-半乳糖組小鼠耳蝸CtBP2蛋白的表達(dá)；（B）定量分析CtBP2蛋白水平的表達(dá)。**P＜0.01。Fig.3 The CtBP2 protein expression in the Control group and D-galactose group.(A)Representative images of CtBP2 protein expression tested by western blot.(B)Quantitative analysis of CtBP2 protein in the Control group and D-galactose group.**P＜0.01.

2.4 D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞線粒體DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG表達(dá)明顯升高

免疫組織化學(xué)激光共聚焦顯微鏡成像顯示DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG[9,10]主要位于D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的細(xì)胞漿（圖4A），由于細(xì)胞漿中僅存在線粒體DNA，說明D-半乳糖主要導(dǎo)致了線粒體DNA的氧化損傷；定量分析8-OHdG在D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞的表達(dá)水平比對照組增加6.80±0.59倍（圖4B）（t=-9.816,P＜0.01）。

圖4 DNA氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG在耳蝸的表達(dá)（A）8-OHdG（紅色）標(biāo)記DNA氧化損傷產(chǎn)物，Myosin VIIa（綠色）標(biāo)記內(nèi)毛細(xì)胞（IHC）和外毛細(xì)胞（OHCs）細(xì)胞漿，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核；（B）定量分析8-OHdG的相對表達(dá)。**P＜0.01。標(biāo)尺=20 μm。Fig.4 The expression of 8-OHdG,a marker of DNA oxidative damage,in the cochlea of Control group and D-galactose group.(A)Representative images of 8-OHdG expression in the cochlea tested by immunohistochemical staining.(B)The relative expression of 8-OHdG in the cochlea of Control group and D-galactose group.**P＜0.01.

3 討論

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們首次證實(shí)耳蝸帶狀突觸數(shù)量減少是D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸早期的病理改變，反映耳蝸帶狀突觸功能的ABR I波幅值也相應(yīng)降低，這一變化和小鼠的自然老化過程類似[8]。利用這一模型，研究者可以在較短的時(shí)間內(nèi)（D-半乳糖注射6周）觀察到耳蝸帶狀突觸數(shù)量的減少和功能的降低，而自然老化小鼠需要大約16周才能觀察到耳蝸帶狀突觸數(shù)量減少[11]。因此，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠可用于老化過程中突觸損傷發(fā)生機(jī)制及干預(yù)的研究。

帶狀突觸僅存在于耳蝸和視網(wǎng)膜，聽覺的形成依賴于耳蝸帶狀突觸的正常功能，耳蝸帶狀突觸突觸前膜囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)、聚集和量子式釋放是維持正常突觸功能的關(guān)鍵[12]。在突觸前膜囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，需要消耗大量內(nèi)毛細(xì)胞線粒體產(chǎn)生的ATP。因此，線粒體在維持突觸功能方面起著至關(guān)重要的作用[13-15]。線粒體在能量代謝的過程中，不僅可以提供維持細(xì)胞正常生理功能的ATP，同時(shí)也會產(chǎn)生活性氧。根據(jù)線粒體老化理論，在老化過程中，隨著機(jī)體氧化/抗氧化的失衡，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生增加，加重線粒體的氧化損傷，損傷的線粒體又產(chǎn)生更多的活性氧，形成惡性循環(huán)[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞線粒體DNA氧化損傷明顯增加，可能導(dǎo)致線粒體功能下降，ATP產(chǎn)生減少，最終不能給耳蝸帶狀突觸突觸前膜囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)提供足夠的能量，導(dǎo)致耳蝸帶狀突觸數(shù)量減少和功能降低。

綜上所述，給小鼠皮下注射D-半乳糖可損傷耳蝸帶狀突觸，導(dǎo)致耳蝸帶狀突觸數(shù)量減少和功能降低，耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞線粒體氧化損傷可能是耳蝸帶狀突觸損傷的重要原因，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠是研究老化過程中耳蝸帶狀突觸損傷機(jī)制及干預(yù)較為理想的動物模型。