酸蝕納米鈦合金種植體的早期骨整合效果

吳偉力，羅軍，應(yīng)于康，朱海錢，陶丹，徐攀舒，于衛(wèi)強

（1.臺州市中心醫(yī)院 口腔科，浙江 臺州 318000；2.上海第九人民醫(yī)院 口腔修復(fù)科，上海 200011）

鈦基種植材料因其良好的生物相容性和機械性能，在骨科、整形外科和口腔科中得到廣泛的應(yīng)用。為提高臨床效果，鈦基種植體的表面修飾一直是材料學(xué)家研究的重要方向[1-3]。研究顯示納米尺度范圍內(nèi)的微結(jié)構(gòu)表面具有更優(yōu)的成骨性能[4-7]。制備微結(jié)構(gòu)的方法也很多，比如微弧氧化、陽極氧化、電飾刻和等離子噴涂等[2，5]。本實驗通過操作較簡單的酸蝕法在鈦合金Ti6Al4V種植體表面構(gòu)建出納米微結(jié)構(gòu)，并將其植入到兔子體內(nèi)，研究其早期成骨性能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料：鈦合金Ti6Al4V種植體（上海金福鈦業(yè)制造廠，螺旋狀，長為5 mm，外徑為2.5 mm）、濃硫酸和雙氧水（分析純試劑）、SYBR Premix Ex Taq（北京TaKaRa公司）等。

1.1.2 儀器：數(shù)字化扭力儀（美國Mark-10公司）、熒光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、Real-Time PCR儀（美國ABI公司）、超聲清洗機（上海躍進醫(yī)用光學(xué)器材廠）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：本實驗以未作表面處理的鈦合金種植體為對照組，酸蝕處理得到的納米鈦合金種植體為納米鈦組。

1.2.2 納米鈦合金種植體的制備及表征：酸蝕法在鈦合金種植體表面制備納米微結(jié)構(gòu)，具體過程[8]：將鈦合金種植體放入蒸餾水中超聲清洗10 min，然后放入酸混合溶液（等體積的濃硫酸和30%雙氧水）中室溫下處理4 h，然后去離子水超聲清洗后吹干備用。微結(jié)構(gòu)分析樣品先進行噴金，然后掃描電鏡下直接觀測鈦合金種植體表面納米微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 體內(nèi)動物實驗：5只成年新西蘭公兔（上?？茖W(xué)院上海動物實驗所提供），體質(zhì)量3～4 kg，標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)飼養(yǎng)。新西蘭大白兔通過肌肉注射甲苯噻嗪（11 mg/kg）和克他命（10 mg/kg）進行全身麻醉，在兔子雙側(cè)脛骨部位進行常規(guī)的備皮和消毒。手術(shù)刀切開脛骨干骺端表面的皮膚及骨膜。先采用小球鉆進行種植體植入部位定位，每側(cè)脛骨植入2個鈦合金種植體（一個是納米鈦種植體，另一個是未作表面處理的鈦合金種植體），種植體間隔約10 mm，然后采用2 mm先鋒鉆進行窩洞的制備，0.9%氯化鈉溶液進行降溫，鈦合金種植體采用自攻的方式植入，最后用2-0縫合線進行分層嚴(yán)密縫合。所有實驗動物在手術(shù)后通過注射慶大霉素預(yù)防感染。實驗大白兔均進行常規(guī)化的飼養(yǎng)，3 d內(nèi)未發(fā)現(xiàn)手術(shù)創(chuàng)口感染現(xiàn)象。

1.2.4 鈣黃綠素標(biāo)記新骨形成：種植術(shù)后2周，隨機選擇1只兔子通過肌注熒光染料鈣黃綠素30 mg/kg進行熒光標(biāo)記新骨。術(shù)后4周，把這只熒光標(biāo)記的兔子按常規(guī)處死。然后將樣品放入40 g/L多聚甲醛溶液內(nèi)進行固定1周。接著進行梯度乙醇的脫水處理，甲基丙稀酸甲酯包埋，最后采用硬組織切片機制作組織切片。采用熒光顯微鏡觀察新骨的生長情況。

1.2.5 體內(nèi)種植體旋出扭力檢測及骨功能基因的表達(dá)[9]：種植體植入后4周，4只兔子按常規(guī)處死，每組樣品可以獲得8個種植體檢測樣品。通過數(shù)字扭力儀將鈦合金種植體從實驗兔的脛骨中旋出，記錄旋出過程中的最大值，然后進行種植體結(jié)合力的分析。接著將種植體表面的骨組織和環(huán)形去骨鉆收集的種植體周圍的骨組織按照Trizol試劑說明提取總RNA。按照試劑說明對RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用實時定量PCR對骨組織中的骨功能相關(guān)基因表達(dá)進行半定量分析。相關(guān)基因的引物設(shè)計β-actin上游：GCGACCTCACCGACTACCT，下游：GCCATCTCGTTC TCGAAGTC；核心結(jié)合因子（core binding factor α1，Runx2）上游：GCCTTCAAGGTGGTAGCCC，下游：CG TTACCCGCCATGACAGTA；I型膠原（collagen 1，Col-1）上游：AGAGCATGACCGATGGATTC，下游：CCTTCTTGA GGGCCAGTC；骨鈣素（osteocalcin，OCN）上游：GAAG CCCAGCGGFGCA，下游：CACTACCTCGCTGCCCTCC。操作過程簡述如下：每個反應(yīng)孔中放入ROX 0.4 μL、cDNA 1 μL、SYBR 10 μL、上下游引物各0.4 μL和去離子水8.8 μL，總共20.6 μL反應(yīng)液，放入實時定量PCR儀中進行擴增得到CT值，采用2-△△CT方法計算實驗組與對照組的目標(biāo)基因表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對定量數(shù)據(jù)進行配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料的表征 低倍鏡下可以看到鈦合金種植體呈典型的螺紋狀（見圖1a），對照組表面微結(jié)構(gòu)為機械劃痕狀（見圖1b），酸蝕處理后的鈦合金種植體表面有高低起伏的凹陷，直徑大約為幾個微米（見圖1c）。超高倍鏡下可以看到鈦合金種植體表面是大小為幾個納米的小突起和小凹陷的納米結(jié)構(gòu)，并且結(jié)構(gòu)較均勻一致（見圖1d）。

圖1 鈦合金種植體微結(jié)構(gòu)

2.2 新骨生長情況 熒光顯微鏡下觀察到種植體周圍新生骨組織呈綠色，鈦種植體不顯色，為黑色。對照組鈦合金種植體周圍的綠色熒光帶成散在的條索狀且熒光強度稍弱（見圖2a），而納米修飾鈦合金種植體周圍熒光帶較寬并且較連續(xù)，熒光強度也有一定程度增強（見圖2b）。

圖2 熒光標(biāo)記鈦合金種植體周圍新骨生長情況（×10）

2.3 種植體對周圍骨組織功能基因表達(dá)的影響

種植體植入動物體內(nèi)4周后，實時定量PCR結(jié)果顯示，納米修飾鈦合金種植體周圍骨組織中的Runx2、Col-1和OCN表達(dá)水平均要顯著高于對照組鈦合金種植體（P＜0.05）。

表1 不同種植體表面骨相關(guān)基因表達(dá)情況（每組n=4

表1 不同種植體表面骨相關(guān)基因表達(dá)情況（每組n=4

與對照組比：aP＜0.05

組別 Runx2 Col-1 OCN對照組 1.0±0.2 1.0±0.3 1.0±0.2納米鈦組 4.3±0.6a 7.6±0.5a 3.6±0.7a

2.4 鈦合金種植體的旋出扭力值 鈦合金種植體植入體內(nèi)4周后，對照組種植體旋出扭力值為（8.3±1.3）kgf，納米修飾種植體旋出扭力值為（13.2±1.8）kgf，納米修飾鈦合金種植體的旋出扭力值顯著高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

混合酸處理是在鈦基種植體表面獲得納米表面微結(jié)構(gòu)的重要方法之一。NANCI等[10]首先報道通過硫酸和雙氧水的混合溶液在鈦基材料的表面獲得相對清潔的納米微結(jié)構(gòu)表面。OLIVEIRA等[8]和BUENO等[11]在體外較系統(tǒng)地研究了這種納米微結(jié)構(gòu)對骨相關(guān)細(xì)胞的行為影響規(guī)律，結(jié)果顯示其可以促進骨向功能的分化。但TAVARES等[12]采用硫酸和雙氧水的混合溶液對純鈦種植體進行了相同的處理，結(jié)果并沒有獲得同樣的納米結(jié)構(gòu)，而是獲得了微米結(jié)構(gòu)，作者分析認(rèn)為純鈦表面的氧化膜可能影響了酸蝕的氧化還原反應(yīng)過程。本研究采用該酸蝕方法對鈦合金種植體進行了相同的處理，雖然鈦合金表面獲得了納米結(jié)構(gòu)，但該納米結(jié)構(gòu)為納米小凹和小突起，與之前文獻(xiàn)報道[8]的納米小孔狀結(jié)構(gòu)有一定的差異，證明不同鈦基材料的氧化膜可能會影響到該酸蝕方法形成的納米微結(jié)構(gòu)。

種植體的早期骨整合效果是決定種植體臨床成功的關(guān)鍵因素。旋轉(zhuǎn)扭力是測試種植體骨結(jié)合力的經(jīng)典方法，旋轉(zhuǎn)扭力越大，骨結(jié)合力越強。因此本研究采用旋轉(zhuǎn)扭力實驗對新型納米鈦種植體的骨整合效果進行評估。結(jié)果顯示納米修飾鈦合金種植體在植入動物體內(nèi)4周后的旋轉(zhuǎn)扭力顯著大于對照組。原因可能是鈦合金表面的納米結(jié)構(gòu)具有更大的比表面積，利于體內(nèi)骨相關(guān)細(xì)胞的黏附和生長[2]；另一方面納米結(jié)構(gòu)的表面可能會吸附血液中的某些黏附蛋白，這些黏附蛋白促進了骨相關(guān)細(xì)胞在新型種植體表面的定植生長[13]。細(xì)胞的早期黏附是種植體在體內(nèi)產(chǎn)生較好骨整合性能的關(guān)鍵一步，為以后骨基質(zhì)的分泌奠定基礎(chǔ)。此外，骨組織的形成是個復(fù)雜的過程，成骨基因的表達(dá)情況可以反應(yīng)骨改建的活躍程度。本實驗檢查了種植體周圍骨組織中的骨功能基因Runx2、Col-1和OCN的表達(dá)情況，這3個功能基因與成骨性能關(guān)系較密切：Runx2是骨相關(guān)細(xì)胞的特異轉(zhuǎn)錄因子，與骨組織的改進有密切關(guān)系；Col-1是一種重要的骨膠原蛋白；OCN是一種重要的骨非膠原蛋白，與骨相關(guān)細(xì)胞的骨向分化關(guān)系密切。結(jié)果顯示種植體植入4周后，納米修飾種植體的骨功能基因表達(dá)顯著高于對照組，說明新型種植體周圍的骨改建更活躍。天然骨組織中無機成分和有機成分的尺寸均在納米范圍內(nèi)，研究證實模擬天然骨組織結(jié)構(gòu)的納米結(jié)構(gòu)更有利于骨組織的生長[1，14]。有學(xué)者在體外研究該納米結(jié)構(gòu)的成骨性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以促進骨功能基因的表達(dá)，作者分析認(rèn)為可能與特有的納米結(jié)構(gòu)促進了黏附蛋白的黏附，從而激起成骨信號通路有關(guān)[8]。本實驗通過熒光染色的方法證實了納米修飾鈦合金種植體周圍具有更多的新骨組織長入。基于以上原因，納米種植體具有更大的骨結(jié)合力。

綜上所述，本實驗通過簡單的酸蝕法在鈦合金種植體表面構(gòu)建納米微結(jié)構(gòu)，然后將新型種植體植入成年兔子脛骨內(nèi)，4周后，測試新型種植體的旋轉(zhuǎn)扭力并分析種植體周圍骨組織的骨功能基因的表達(dá)，結(jié)果顯示酸蝕法在鈦合金表面形成的納米結(jié)構(gòu)提高了種植體的早期骨整合效果。