多花黃精誘導(dǎo)愈傷組織與不定芽培養(yǎng)基篩選

葉雨心，任夢婷，易偉豪，齊 青，彭代銀,2，邢世海,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012)

多花黃精Polygonatum cyrtonema是百合科黃精屬多年生草本植物，其根莖為傳統(tǒng)中藥材。同屬的黃精P. sibiricum、滇黃精P. kingianum亦做藥用來源，以干燥根莖入藥[1]。黃精始載于《名醫(yī)別錄》，列為上品，其功效 “主補(bǔ)中益氣，除風(fēng)濕，安五臟。久服輕身、延年、不饑”[2]。具有抗衰老、提高免疫力、調(diào)節(jié)造血、抗病原微生物、抗腫瘤、降血糖等藥理作用，現(xiàn)臨床應(yīng)用于內(nèi)科疾病、男性不育癥、婦科疾病[3]。而黃精、多花黃精、滇黃精中以多花黃精質(zhì)量最佳，因其外形似姜稱為姜形黃精。多花黃精主產(chǎn)于安徽、貴州、湖南、浙江等省[4]，始載于《雷公炮炙論》，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎等功效。其根莖中的主要化學(xué)成分為多糖和甾體皂苷。多糖具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗衰老、抗化學(xué)性肝損傷等作用，甾體皂苷具有降血脂、抗病毒、改善記憶障礙等作用[5]。

黃精可藥食兩用，故其市場需求量逐年上升，而野生黃精植物資源越來越少，不足以滿足市場需求。多花黃精的傳統(tǒng)繁殖方式有根狀莖繁殖(無性繁殖)和種子繁殖(有性繁殖)，這兩種繁殖方式所需時(shí)間較長[6]。與常規(guī)無性繁殖方法相比，組織培養(yǎng)繁殖可在短期內(nèi)獲得性狀穩(wěn)定的優(yōu)良種苗。利用組織培養(yǎng)手段培育的種苗，除了保持母本的優(yōu)良性狀、增加繁殖材料、縮短育苗周期之外，還可以為建立優(yōu)良苗圃繁育基地節(jié)省育苗成本。因此，開展多花黃精的離體組織培養(yǎng)和再生植株是有必要的[7]。劉紅美等[8]建立了多花黃精組織培養(yǎng)快速繁殖體系，在前人基礎(chǔ)上增加了生根、煉苗及移栽的系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為在快速繁殖方面2,4-D相對于NAA更有利于多花黃精的不定芽誘導(dǎo)。周建金等[9]認(rèn)為，利用多花黃精側(cè)芽更容易誘導(dǎo)不定芽，并且變異度也相對較低。劉芳源等[10]認(rèn)為，MS + 6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+ IAA 0.3 mg·L-1為最適的快繁培養(yǎng)基。本試驗(yàn)綜合考慮多種植物生長調(diào)節(jié)劑及其濃度組合對多花黃精愈傷組織誘導(dǎo)的影響，采取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇最佳的愈傷組織培養(yǎng)基，同時(shí)篩選通過器官發(fā)生方式誘導(dǎo)多花黃精芽發(fā)生的適宜培養(yǎng)基，為建立完整的多花黃精組織培養(yǎng)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 多花黃精根狀莖。

1.1.2 試劑 6-BA、NAA、KT、2,4-D(上海源聚生物科技有限公司，批號070416、批號061212、批號070822、批號070605)；MS培養(yǎng)基(杭州木木生物科技有限公司，批號20170901)；蔗糖、瓊脂、10%次氯酸鈉、75%乙醇、脫脂棉購自國藥集團(tuán)。

1.1.3 儀器 立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號YXQ-LS-100S11)；凈化工作臺(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司，型號SF-CT-2A)；接種器械滅菌器(上海詠星生物科技有限公司，型號JZ-160)。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒與接種 將多花黃精的根莖和帶芽根莖洗凈，剪去須根后用流動自來水沖洗30 min，備用。用無菌濾紙擦干后，在超凈工作臺上用10%次氯酸鈉浸泡10 min后，用無菌水沖洗3～5次，再用無菌濾紙擦干，切成0.5 cm2大小、0.2～0.3 cm厚度的組織塊接種到培養(yǎng)基上，每一個(gè)激素配方接種12瓶，每瓶接種3～4塊外植體材料。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 選取 6-BA、NAA、2,4-D、KT，每種生長調(diào)節(jié)劑設(shè) 3個(gè)濃度水平(表1)。選用L9(34)正交設(shè)計(jì)，以愈傷組織的產(chǎn)生率為指標(biāo)，考察4種植物生長調(diào)節(jié)劑對多花黃精愈傷組織誘導(dǎo)的影響。培養(yǎng)基均加瓊脂粉6 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，pH 5.5～6.5。高壓蒸汽滅菌鍋0.1 Mpa壓力121 ℃溫度下，進(jìn)行高溫高壓滅菌30 min。培養(yǎng)條件為光照12 h·d-1，光照強(qiáng)度1600 lx，培養(yǎng)室溫度25 ℃。培養(yǎng)15 d后，觀察污染情況和愈傷組織誘導(dǎo)情況；培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)污染率和愈傷組織誘導(dǎo)率，愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織外植體數(shù)/接種后未污染外植體數(shù)×100%。不同培養(yǎng)基配方的愈傷組織誘導(dǎo)率必須除去污染的材料，方可體現(xiàn)出該培養(yǎng)基配方的誘導(dǎo)效果。

1.2.3 最佳培養(yǎng)基驗(yàn)證試驗(yàn) 以正交實(shí)驗(yàn)篩選的最佳生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基配方接種多花黃精的根莖和帶芽根莖組織塊，外植體塊大小、清洗方式和消毒方法同上，接種60瓶，每瓶接種3塊外植體。培養(yǎng)基滅菌處理措施、接種材料培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)15 d后，觀察污染情況和愈傷組織誘導(dǎo)情況；培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)材料的污染率和愈傷組織誘導(dǎo)率，分析并驗(yàn)證篩選的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方的效果。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑種類及其濃度(mg·L-1)Table 1 Plant growth regulators and their concentrations

1.2.4 器官發(fā)生方式的芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 使用三種不同的培養(yǎng)基配方：(1) MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1、(2) MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.2 mg·L-1、(3) MS + KT 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1，將多花黃精的根狀莖外植體接種在培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基配方接種12瓶，每瓶接種3塊外植體，培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)20 d后觀察芽誘導(dǎo)效果，統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)率。芽誘導(dǎo)率=形成芽外植體數(shù)/接種后未污染外植體數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d后外植體形成愈傷組織(圖1: A)。培養(yǎng)40 d后愈傷組織誘導(dǎo)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2。方差分析表明，6-BA、KT、NAA和2,4-D對多花黃精愈傷組織誘導(dǎo)效果較顯著(F=7.88 ＞ F0.01=6.59)，極差分析表明，4種植物生長調(diào)節(jié)劑作用強(qiáng)弱依次為 KT ＞ 2,4-D ＞ NAA ＞ 6-BA，各生長調(diào)節(jié)劑的最佳濃度分別是 1.0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.1 mg·L-1、2.0 mg·L-1，即對于多花黃精愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為 MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ KT 1.0 mg·L-1。

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基驗(yàn)證

在正交試驗(yàn)獲得的最佳培養(yǎng)基上接種60瓶共180塊外植體，培養(yǎng)15 d后，有42塊外植體污染，未污染的外植體部分出現(xiàn)愈傷組織；40 d后污染外植體達(dá)47塊，污染率26.11%，未污染的材料有45塊形成愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為39.10%，篩選的該培養(yǎng)基配方的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于試驗(yàn)設(shè)計(jì)中安排的各培養(yǎng)基配方，表明該培養(yǎng)基配方適用于多花黃精愈傷組織誘導(dǎo)。

2.3 器官發(fā)生方式的芽誘導(dǎo)

在芽誘導(dǎo)方面，培養(yǎng)基 MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.2 mg·L-1和 MS + KT 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1中未形成不定芽。培養(yǎng)基 MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1則成功地通過器官發(fā)生途徑形成了不定芽，芽誘導(dǎo)率 66.7%(圖 1:B)，該培養(yǎng)基是通過器官發(fā)生方式誘導(dǎo)多花黃精芽形成的較為適宜的培養(yǎng)基。

圖1 多花黃精愈傷組織(15 d)與不定芽(20 d)誘導(dǎo)Fig. 1 Callus and adventitious buds induction of Polygonatum cyrtonema

3 討論

研究表明，6-BA對黃精愈傷組織生長有顯著效果[11—12]；萬學(xué)鋒等[13]也認(rèn)為6-BA比其他細(xì)胞分裂素更有利于多花黃精的分化。本研究表明，細(xì)胞分裂素 KT對多花黃精愈傷組織的誘導(dǎo)有顯著影響，6-BA對多花黃精愈傷組織的誘導(dǎo)作用不顯著，與前人研究結(jié)果略有不同，但與2,4-D等生長調(diào)節(jié)劑配合使用有一定的促進(jìn)效果。說明多花黃精愈傷組織的誘導(dǎo)對生長調(diào)節(jié)劑的要求可能不同；另外，本研究選擇的生長調(diào)節(jié)劑組合有所不同[11]，而這些生長調(diào)節(jié)劑之間可能存在相互作用。

李鶯等[14]發(fā)現(xiàn)，黃精根莖及地上嫩莖較葉片更容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；裴莉昕等[15]的研究則認(rèn)為，黃精嫩葉為誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體。本研究用多花黃精的根莖作為外植體同樣誘導(dǎo)出愈傷組織，且誘導(dǎo)效果較好。

陳松樹等[16]以多花黃精的葉片為外植體，認(rèn)為愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為：MS + 6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 4.0 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1，與本研究采用根狀莖為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基配方有較大差異，可見不同種類的外植體由于分化程度、生理狀態(tài)、內(nèi)源激素含量等差異，導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)要求的植物生長調(diào)節(jié)劑及其組合也有較大的差異。

劉紅美等[8]認(rèn)為，MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.2 mg·L-1較適合多花黃精叢生芽的發(fā)生。在本研究的器官發(fā)生芽誘導(dǎo)中，該培養(yǎng)基未見芽的形成，可見器官發(fā)生方式直接成芽和誘導(dǎo)叢生芽的發(fā)生都是成芽過程，但屬于不同的芽再生方式，對植物生長調(diào)節(jié)劑的需求存在一定的差異。

綜上所述，本研究中，誘導(dǎo)多花黃精愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方為MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ 2,4-D 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ KT 1.0 mg·L-1, 愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)39.10%；培養(yǎng)基MS + 6-BA 4.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1可作為通過器官發(fā)生方式誘導(dǎo)多花黃精直接成芽的合適培養(yǎng)基。