裸花紫珠治療燒燙傷模型大鼠活性部位的篩選及其作用機制研究

羅喻超，劉辰鵬，黃明浩，張 仲，張俊清，姚瑰瑋

海南醫(yī)學院藥學院，?？?571119

裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn.為馬鞭草科紫珠屬植物，主要分布于我國廣東、廣西和海南等地[1]。作為海南大宗性地道藥材，也是海南黎族藥之一，主要分布于海南白沙、五指山和瓊中等地。裸花紫珠可全年采收，取地上干燥部分，去除雜質(zhì)，有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消腫、祛風祛濕之功效，主治化膿性炎癥、急性傳染性肝炎、呼吸道及消化道出血、創(chuàng)傷出血等癥，外用治療燒、燙傷及外傷出血等，現(xiàn)代研究表明，裸花紫珠主要含有黃酮、鞣質(zhì)、萜類和酚類等成分[2-4]。

目前對裸花紫珠的研究主要以止血為主，針對裸花紫珠治療燒燙傷的功效及其活性部位與作用機制方面的研究較少[5]。裸花紫珠提取物可抗感染、促進上皮生長和加快創(chuàng)面愈合這對裸花紫珠治療燒燙傷的研究提供了基礎和方向。本文以正丁醇、乙酸乙酯、石油醚及水層萃取裸花紫珠流浸膏的不同活性部位，并以大鼠燙傷面積大小、傷口性狀，如顏色、軟硬程度、血清中TGF-β1和VEGF濃度等為指標，探究裸花紫珠治療燒燙傷的活性部位及作用機制，為進一步研究提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥材與試劑

裸花紫珠藥材采自海南省白沙縣，經(jīng)海南醫(yī)學院藥學院田建平教授鑒定為馬鞭草科紫珠屬馬草科裸花紫珠(Callicarpanudiflora)的地上部分。正丁醇、乙酸乙酯、石油醚均為國產(chǎn)試劑，購買于廣州化學試劑廠；硫化鈉(蘇州康碩化工有限公司)；苯扎溴銨(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司)；水合氯醛(上海貝合化工有限公司)，所有試劑均為分析純，水為超純水。京萬紅燙傷膏(SSD)(昆明圣火藥業(yè)有限公司)；4%多聚甲醛通用型組織固定液(Bio sharp)；大鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA檢測試劑盒、大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)ELISA檢測試劑盒由蘇州卡爾文生物科技有限公司提供。

1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠，雄性，體重180～200 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供(許可證號：SCXK(粵)2013-0002，質(zhì)量合格證號：No.44007200039675)。

1.3 儀器

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SO9001型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；均漿機(天津津立儀器設備科技發(fā)展有限公司)；高速離心機(深圳市科力易翔儀器設備有限公司)；集熱式磁力攪拌器(上海拜瀾儀器設備有限公司)；Spectra Max 190全波長酶標儀(美國Molecular Devices)。

2 材料與方法

2.1 藥物的制備

稱取裸花紫珠藥材粉碎成粗粉，加入純凈水浸泡2 h，加熱回流提取3次，加水量分別為藥材質(zhì)量的12、10、10倍。每次提取1 h后過濾，合并3次濾液，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 °C干燥24 h，迅速轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻0.5 h，所得浸膏即為裸花紫珠水提取物，平均浸膏得率為20.0%[6]。

取裸花紫珠水提取物浸膏，加適量水溶解，根據(jù)溶劑提取法按1∶1比例分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取兩次，超聲15 min后離心，取上層，得到石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位3個樣。各萃取部位加熱減壓回收溶劑，濃縮至流浸膏狀。剩余水層部分亦濃縮至流浸膏狀。以上部位分別記為裸花紫珠石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水層部位，以裸花紫珠原藥材質(zhì)量計算，得率依次為6.0%、3.5%、2.3%、8.2%，加上前述水提取物共5個提取部位，分別用卡波姆以35∶1混合均勻，得到稠度適宜的藥膏一同進行抗燙傷藥效學研究。

2.2 藥效學實驗

2.2.1 燙傷造模與治療

將SD大鼠背部的毛用剃須刀剃除約16 cm2(約4 cm×4 cm)，剩余的短毛用6%的硫化鈉溶液浸潤一分鐘左右，用棉球除去，再用清水沖洗干凈。造模采用Walker[5]和Stevenson[6]的方法，進行適當?shù)奈⒄{(diào)。即先用水合氯醛腹腔注射300 mg/kg麻醉SD大鼠，然后用90 °C熱水在大鼠背部脫毛處燙10 s，傷口大小約為7.5 cm2(3 cm×2.5 cm)。燙傷后，所有大鼠隨機分為7組，每組10只，分別為模型組、裸花紫珠水提取物組、裸花紫珠流浸膏水層組、裸花紫珠石油醚部位組、裸花紫珠乙酸乙酯部位組、裸花紫珠正丁醇部位組、京萬紅燙傷軟膏劑實驗組(SSD)。在造模24 h后，各組在傷口處分別均勻涂抹0.3 g對應藥膏，模型組涂抹等質(zhì)量卡波姆。每日給藥一次，給藥后用醫(yī)用紗布包裹傷口，持續(xù)4周，各組大鼠分籠單獨飼養(yǎng)，防止互相撕咬傷口。在大鼠給藥后用醫(yī)用紗布包裹傷口，以隔離藥膏氣味，減少實驗誤差。

2.2.2 傷口愈合率

每日同一時間給藥，觀察傷口并記錄傷口的顏色、軟硬程度、分泌與腫脹情況。在燙傷后第1、5、8、12、15、18、21天，將大鼠固定于帶長度刻度的網(wǎng)格板上，拍照。再用Image J軟件處理，按照片中網(wǎng)格板刻度調(diào)整圖片對應實際大小一致，計算傷口的面積。在測量大鼠傷口面積時容易產(chǎn)生誤差，通過采用測量板及去極值等方法，減少實驗誤差。

計算愈合后剩余傷口百分率公式為：

某日剩余傷口百分率=某日的傷口面積/最初的傷口面積×100%[7]

2.2.3 樣本的采集與處理

在燙傷后第2、7、14和21天對大鼠進行眼眶后取血，取約2 mL血液，靜置20 min后，以3 000 rpm離心5 min，取上層血清，保存血清于-80 °C冰箱中備用。在第21天，以10%水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)麻醉老鼠后，將傷口剝離深至肌層，之后脫頸處死大鼠。取部分傷口組織，用4%多聚甲醛固定液固定、石蠟切片、切片用HE染色。染色后觀察創(chuàng)傷表皮中汗腺、炎細胞浸潤、纖維組織增生、組織變性壞死和鈣化等。

2.2.4 大鼠血清中 TGF-β1和VEGF含量測定

采用酶聯(lián)免疫法(Elisa)測定大鼠血清中TGF-β1和VEGF含量。依照ELISA試劑盒的說明書進行操作，Spectra Max 190全波長酶標儀測定檢測板各孔吸光度，計算對應的細胞因子濃度。

2.3 數(shù)據(jù)處理

3 結果與分析

3.1 宏觀觀測結果

將調(diào)整刻度一致后的各組大鼠不同時間傷口照片排列到一起，可直觀觀察各組大鼠傷口恢復情況。

圖1 傷口的總體觀測Fig.1 General observation of the wound注：A.模型組 B.石油醚 C.乙酸乙酯 D.正丁醇 E.水提取物組 F.水層組 G.SSD組。Note:A.Model group B.Petroleum ether group C.Ethyl acetate group D.Butanol group E.Water extract group F.Water layer group G.SSD group.

結果見圖1，從第1天到第12天，SSD組藥膏與傷口較好的黏合，傷口比較濕潤、變軟，傷口痂皮較薄，有少許組織液滲出；水層跟模型組傷口有較多組織液滲出，炎癥現(xiàn)象較明顯；由于裸花紫珠浸膏本身的顏色，水提取物組及水層組的傷疤顏色較深；石油醚組與正丁醇組的傷疤表現(xiàn)為干燥、厚實，呈深棕色。每組的傷疤處都有一定的出血和分泌物流出。

第15天后，各組的傷口均不同程度的好轉(zhuǎn)，出血及組織液滲出現(xiàn)象消失，正丁醇組、石油醚組與水提取物組的傷疤較其它各組明顯要薄。第18天，正丁醇組、與石油醚組與水提取物組的傷口愈合程度明顯高于其它各組，其中水提取物組與石油醚組的傷口愈合程度最高。

第21天，水提取物組與石油醚組的愈合程度最好，傷口已基本愈合，皮膚彈性好且高度與正常皮膚無異，創(chuàng)傷處表皮光滑，顏色也接近于正常皮膚。

3.2 組織病理學切片檢查

如圖2所示，模型組可見包含有炎癥細胞的大面積潰瘍形成，在真皮層中有輕度的炎癥和中度的出血，表皮有嚴重的剝落和結痂，這都表明傷口未完成愈合。

圖2 各組大鼠傷口病理切片圖(HE染色)Fig.2 Pathologic sections of wound (HE staining) in each group of rats注：A.模型組 B.石油醚組 C.乙酸乙酯組 D.正丁醇組 E.水提取物組 F.水層組 G.SSD組(圖ACEG 200×，圖BDF 100×)。Note:A.Model group B.Petroleum ether group C.Ethyl acetate group D.Butanol group E.Water extract group F.Water layer group G.SSD group (Figure ACEG 200 x,Figure BDF 100 x).

水層組大鼠病理切片可見包含有炎癥細胞的大面積潰瘍形成，在真皮層中有輕度的炎癥和輕度的出血，表皮有剝落和結痂，與模型組的結果相似。SSD組與水提取物組大鼠病理切片中，可見表皮有輕度的增生，真皮層完整，真皮內(nèi)有大量汗腺生成，成纖維細胞產(chǎn)生較多膠原纖維，同時成纖維細胞數(shù)量減少、胞核變細長，變?yōu)槔w維細胞，表明傷口已基本愈合，與模型組形成鮮明的對比。石油醚組與正丁醇組大鼠病理切片中，可見與SSD組和水提取物組結果相似，表明傷口已基本愈合。乙酸乙酯組大鼠病理切片可見表皮大部分壞死組織脫落，表皮爬行于創(chuàng)緣表面，有較多成纖維細胞及毛細血管的生成，真皮層中有輕度的炎癥細胞浸潤。治療效果稍好于模型組，但依然沒有完全愈合。綜上，組織病理學檢查的結果與總體觀測的結果基本吻合。

3.3 傷口面積的測量

如表1所示，前8天中各組的剩余傷口百分率基本在同一水平。但在12天之后，水提取物組剩余傷口百分率最小，石油醚組與正丁醇組次之，且均與模型組有較大差異；石油醚組剩余傷口百分率與乙酸乙酯和水層組有較大差異；而乙酸乙酯組與水層組均與模型組剩余傷口百分率相近；第15天起和第21天時，水提取物組與石油醚組的剩余傷口百分率要顯著低于模型組(P<0.05)，其中水提取物組的最低。

3.4 血清中TGF-β1和VEGF濃度變化分析

采用ELISA法測定各組大鼠不同時間點血清中TGF-β1、VEGF濃度，結果見表2。第21天時，可見石油醚組與水提取物組的TGF-β1水平低于模型組，有顯著性差異；第7天時，石油醚組的VEGF水平高于模型組，有顯著性的差異。

4 結論

燙傷的愈合可分為三個有重疊的階段，依次為炎癥期、組織增生重塑期和成熟期[8]。石油醚組的VEGF濃度在早期出現(xiàn)了明顯的上調(diào)。進入組織增生重塑期后，水提取物組傷口愈合最好，石油醚組和正丁醇組次之，裸花紫珠促進傷口愈合的功效在這一階段開始體現(xiàn)。在最后組織增生的成熟期，水提取物組的表皮和真皮恢復得最好，傷疤最小，石油醚組次之。在第21天時，TGF-β1的表達水平最低。表明裸花紫珠可能是通過TGF-β1信號通路來減少疤痕的形成。

表1 不同恢復時間各組剩余傷口百分率變化

注：n=7，與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:n=7，Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01.

表2 血清中TGF-β1、VEGF的濃度變化

注：n=7，與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:n=7，Compare with control,*P< 0.05;**P<0.01.

在TGF-β因子家族中，有很多因子與組織的形成和修復有關[9]。而在血管再生、膠原合成、細胞外基質(zhì)的沉積和皮膚瘢痕的形成等傷口愈合的一系列過程中，TGF-β1是一個十分重要的因子[10]。TGF-β1作為一個促進傷口愈合的因子過度的表達會造成傷口的過度愈合，進而增加疤痕的形成。因此，在傷口愈合的后期，低濃度的TGF-β1可以減少疤痕的形成。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是在皮膚中最有效的促血管生成的生長因子之一，其表達水平的高低可以影響皮膚修復的速度和質(zhì)量[11]。VEGF有助于傷口攣縮，VEGF表達不足會導致傷口愈合異常，但高水平的VEGF可以加劇瘢痕組織的形成[12，13]。

綜上所述，在大鼠深二度燙傷模型中，裸花紫珠流浸膏水提取物治療效果最好，石油醚層與正丁醇組次之，石油醚層組與正丁醇層組相較與乙酸乙酯組、水層組的治療燙傷效果更強，初步猜測裸花紫珠治療燒燙傷的活性部位在石油醚層或正丁醇層中；裸花紫株水提取物組相較于SSD都表現(xiàn)出更強的促進傷口愈合的功效，并能減少傷疤的形成。這些功效的作用機制可能是由于在早期裸花紫珠使VEGF上調(diào)，有助于傷口攣縮，在后期下調(diào)了TGF-β1使得傷疤形成的減少。裸花紫珠治療燒燙傷具體活性成分還需要做進一步的驗證和探究。