木香烴內(nèi)酯抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷與脂肪變性

班篤敬，魏 煒，申 超，繆雪華，劉文生*

1南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普外科，南京 210014

酒精性脂肪肝病(alcohol fatty liver disease，AFLD)是因長期大量攝入酒精導(dǎo)致的以肝細(xì)胞脂肪變性為主要表現(xiàn)的肝損害性疾病，若疾病持續(xù)進(jìn)展，則會導(dǎo)致酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化，引起肝細(xì)胞壞死甚至肝功能衰竭[1]。近年來酒精性脂肪肝在我國的發(fā)病率有所升高，酒精已成為導(dǎo)致肝臟損傷的第二大因素。長期大量攝入酒精，可干擾脂肪氧化，同時促進(jìn)脂肪生成，引發(fā)脂質(zhì)代謝異常，脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積后引起肝細(xì)胞受損[2]。目前，酒精性脂肪肝的臨床藥物治療研究鮮有突破。

木香烴內(nèi)酯(costunolide)是一倍半萜內(nèi)酯類化合物，是中藥木香的主要化學(xué)成分和質(zhì)控成分之一。近年來研究表明木香烴內(nèi)酯具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤、降血糖、抗菌、抗炎等作用[3]。新近研究還發(fā)現(xiàn)，木香烴內(nèi)酯在動物模型中能夠減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷，可以有潛力成為一個具有保肝作用的藥物[4]。本研究建立乙醇體外誘導(dǎo)人LO2肝細(xì)胞損傷模型，考察木香烴內(nèi)酯對肝細(xì)胞損傷及脂肪變性的保護(hù)作用與初步機(jī)制與可能靶標(biāo)，為木香烴內(nèi)酯用于酒精性脂肪肝的防治提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 主要藥品與抗體

木香烴內(nèi)酯(純度99.08%)、AMPK抑制劑BML-275(純度99.73%)購自美國MedChemExpress公司，溶解于DMSO備用。Western blot實驗用一抗SREBP-1c、PPARα、p-AMPK、AMPK、GAPDH及二抗Goat Anti-Rabbit-IgG-HRP購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 實驗儀器

主要實驗儀器如下：光學(xué)顯微鏡 (日本Olympus公司)、超低溫冰箱(日本Sanyo公司)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)、超純水儀(美國Millpore公司)、核酸蛋白分析儀(美國Beckman公司)、Real-time PCR儀(美國Bio-Rad公司)、多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)、電泳槽(美國Bio-Rad公司)、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人LO2肝細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。在含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT實驗檢測細(xì)胞活力

LO2細(xì)胞接種于96孔板，每孔180 μL，1×104個細(xì)胞/孔，加入乙醇和/或木香烴內(nèi)酯處理48 h。后加入5 mg/mL MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移除上清，每孔加入200 μL DMSO充分溶解結(jié)晶物。在多功能酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔OD值，同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT)與對照孔(細(xì)胞、培養(yǎng)基、MTT)，每組6個復(fù)孔。藥物處理組的細(xì)胞活力標(biāo)示為對照組的百分比。

2.3 細(xì)胞上清肝酶水平的測定

LO2細(xì)胞接種于6孔板，加入乙醇或木香烴內(nèi)酯處理48 h。取每組細(xì)胞上清液，按照試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)方法測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性。每組6個復(fù)孔，藥物處理組的ALT或AST水平表示為對照組的倍數(shù)。

2.4 油紅O染色

LO2細(xì)胞接種于放有無菌蓋玻片的 24 孔培養(yǎng)板，加入乙醇和/或木香烴內(nèi)酯處理48 h。后以 PBS洗滌3遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.5%油紅O染液(購自碧云天生物技術(shù)公司)室溫染色30 min，60%異丙醇漂洗30 s，蒸餾水洗30 s至背景透明，明膠甘油封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況。

2.5 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量測定

LO2細(xì)胞接種于6孔板，加入乙醇和/或木香烴內(nèi)酯處理48 h。后棄上清，PBS 洗滌細(xì)胞3遍，加入胰酶消化，收集細(xì)胞懸液，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)裂解細(xì)胞2 min，離心取上清，按試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書方法檢測上清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的含量。每組6個復(fù)孔，藥物處理組的TG或TC水平表示為對照組的倍數(shù)。

2.6 Real-time PCR檢測

LO2細(xì)胞接種于6孔板，加入乙醇、木香烴內(nèi)酯和/或BML-275處理48 h。細(xì)胞內(nèi)RNA提取按照Trizol Reagent說明書進(jìn)行，紫外分光光度計檢測純度和定量。cDNA的合成采用40 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，其中M-MLV 200 U，oligo(dT)(15 primer)10 ng/mL，4×dNTP(10 mM)4 μL，5×RT buffer 8 μL，無RNase水補(bǔ)至40 μL。42 ℃反應(yīng)15 min，95 ℃滅活M-MLV酶5 min。根據(jù)Genebank資料自行設(shè)計引物(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。以GAPDH作為內(nèi)參物，PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包含cDNA 2 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，SYBR Premix Ex Taq酶10 μL，用DEPC水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，共擴(kuò)增40個循環(huán)。測得目的基因擴(kuò)增的動力學(xué)曲線與Ct值。目的基因mRNA的倍數(shù)改變通過與GAPDH相比較計算得出。

表1 引物序列

2.7 Western blot檢測

LO2細(xì)胞接種于6孔板，加入乙醇、木香烴內(nèi)酯和/或BML-275處理48 h。用冰冷的RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，收集裂解物，-80 ℃儲藏過夜。蛋白混合液融化，于4 ℃、12 000 rpm下離心15 min，吸取上清以BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，非特異性封閉；加入相應(yīng)一抗，4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行雜交。加入ECL發(fā)光液，以凝膠成像儀(Bio-Rad)進(jìn)行成像與半定量分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

圖1 木香烴內(nèi)酯抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷Fig.1 Costunolide inhibits ethanol-induced hepatocyte injury注：(A)MTT實驗檢測乙醇對LO2細(xì)胞活力的影響，與對照組相比，*P<0.05；(B)MTT實驗檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細(xì)胞活力的影響，與對照組相比，*P<0.05，與乙醇組相比，#P<0.05；(C)MTT實驗檢測木香烴內(nèi)酯在0-80 μM范圍內(nèi)對LO2細(xì)胞活力的影響；(D,E)試劑盒檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細(xì)胞上清ALT和AST水平的影響，與對照組相比，*P<0.05，與乙醇組相比，#P<0.05。Note:(A) MTT assay for detecting the effects of ethanol on LO2 cell viability,*P<0.05;(B) MTT assay for detecting the effects of Costunolide on ethanol-induced LO2 cell injury,*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ethanol;(C) MTT assay for detecting the effects of Costunolide at 0-80 μM on LO2 cell viability,(D,E) Measurements of supernatant ALT and AST levels in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide,*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ethanol.

3 結(jié)果

3.1 木香烴內(nèi)酯抑制乙醇導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷

首先建立乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型。MTT檢測結(jié)果顯示，當(dāng)乙醇濃度為100 mM或高于此濃度時顯著抑制LO2細(xì)胞活力，呈劑量依賴性(圖1A)。據(jù)此選擇濃度為100 mM的乙醇作為后續(xù)實驗中誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的條件。以MTT實驗考察木香烴內(nèi)酯對乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的影響，發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯在40 μM濃度時可顯著改善乙醇對LO2細(xì)胞活力的抑制作用(圖1B)，但單獨(dú)作用時，對LO2細(xì)胞活力沒有顯著影響(圖1C)。進(jìn)一步考察木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的肝細(xì)胞上清液中ALT和AST水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，乙醇導(dǎo)致LO2細(xì)胞上清液中ALT和AST水平顯著升高，而木香烴內(nèi)酯在40 μM濃度時顯著降低乙醇刺激的LO2細(xì)胞上清液中ALT與AST含量(圖1D、1E)。上述結(jié)果表明，木香烴內(nèi)酯可以抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。

3.2 木香烴內(nèi)酯抑制乙醇導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂質(zhì)生成

以油紅O染色檢測肝細(xì)胞中的脂滴堆積情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，100 mM濃度的乙醇作用48 h后可明顯促進(jìn)LO2細(xì)胞中的脂質(zhì)生成；而木香烴內(nèi)酯在20、40 μM濃度時可抑制乙醇誘導(dǎo)的脂質(zhì)生成(圖2A)。利用試劑盒檢測LO2細(xì)胞中TG和TC的水平，結(jié)果顯示與對照組對比，乙醇可顯著升高LO2細(xì)胞中TG的水平，而木香烴內(nèi)酯在40 μM濃度時顯著降低乙醇刺激的LO2細(xì)胞中的TG含量(圖2B)。類似地，乙醇也可顯著升高LO2細(xì)胞中TC的水平，而木香烴內(nèi)酯在20、40 μM濃度時顯著降低乙醇刺激的LO2細(xì)胞中的TC的含量(圖2C)。上述結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯可以抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)生成。

圖2 木香烴內(nèi)酯抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)生成Fig.2 Costunolide inhibits ethanol-induced lipogenesis in hepatocytes注：(A)油紅O染色檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細(xì)胞中脂質(zhì)堆積的影響(放大倍數(shù)：400X)；(B)試劑盒檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細(xì)胞中TG含量的影響，與對照組相比，*P<0.05；與乙醇組相比，#P<0.05；(C)試劑盒檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細(xì)胞中TC含量的影響，與對照組相比，*P<0.05，與乙醇組相比，#P<0.05。Note:(A) Oil-red O staining for evaluating the effects of costunolide on ethanol-induced lipid accumulation in LO2 cells (400X magnification);(B) Measurement of intracellular TG levels in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide,*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ethanol;(C) Measurement of intracellular TC levels in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide,*P<0.05 vs control,#P<0.05 vs ethanol.

3.3 木香烴內(nèi)酯調(diào)控肝細(xì)胞中脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)是對肝細(xì)胞中脂質(zhì)的合成具有重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，其中SREBP-1c具有正向調(diào)控脂質(zhì)生成的作用[5]，而PPARα起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用[6]。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，乙醇可顯著促進(jìn)LO2細(xì)胞中SREBP-1c的mRNA表達(dá)，而抑制PPARα的mRNA表達(dá)；與乙醇模型組相比，木香烴內(nèi)酯在20和40 μM濃度時顯著降低SREBP-1c的mRNA表達(dá)并上調(diào)PPARα的mRNA表達(dá)(圖3A)。以Western blot檢測SREBP-1c和PPARα的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，乙醇可顯著促進(jìn)LO2細(xì)胞中SREBP-1c的蛋白表達(dá)，而抑制PPARα的蛋白表達(dá)；與乙醇模型組相比，木香烴內(nèi)酯在40 μM濃度時顯著降低SREBP-1c的蛋白表達(dá)并上調(diào)PPARα的mRNA表達(dá)(圖3B)。綜合上述表明，木香烴內(nèi)酯能夠調(diào)控肝細(xì)胞中脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，與改善乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性相關(guān)。

圖3 木香烴內(nèi)酯調(diào)控肝細(xì)胞中脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)Fig.3 Costunolide regulates the expression of lipogenesis-related transcription factors in hepatocytes注：(A)Real-time PCR檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細(xì)胞中SREBP-1c、PPARα的mRNA表達(dá)的影響，與對照組相比，**P<0.01，與乙醇組相比，#P<0.05，##P<0.01；(B)Western blot檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細(xì)胞中SREBP-1c、PPARα的蛋白表達(dá)的影響，與對照組相比，**P<0.01，與乙醇組相比，#P<0.05，##P<0.01。Note:(A) Real-time PCR analyses for evaluating the effects of costunolide on mRNA expression of SREBP-1c and PPARα in ethanol-stimulated O2 cells treated with costunolide,**P<0.01 vs control,#P<0.05 vs ethanol,##P<0.01 vs ethanol;(B) Western blot analyses for evaluating the effects of costunolide on protein expression of SREBP-1c and PPARα in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide,**P<0.01 vs control,#P<0.05 vs ethanol,##P<0.01 vs ethanol.

3.4 木香烴內(nèi)酯依賴于激活A(yù)MPK調(diào)控肝細(xì)胞中脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

進(jìn)一步探究木香烴內(nèi)酯的可能作用靶標(biāo)。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞的能量感受器，在肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用，可以成為藥物干預(yù)酒精性脂肪肝的分子靶標(biāo)[7]。Western blot檢測結(jié)果顯示，乙醇顯著抑制LO2細(xì)胞中AMPK的磷酸化，而木香烴內(nèi)酯在20、40μM時顯著上調(diào)乙醇刺激的LO2細(xì)胞中AMPK的磷酸化(圖4A)，提示能夠增強(qiáng)AMPK的活性。以AMPK的特異性抑制劑BML-275作為工具藥，考察木香烴內(nèi)酯對肝細(xì)胞脂質(zhì)的調(diào)控是否依賴于激活A(yù)MPK。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，BML-275在10μ時顯著削弱木香烴內(nèi)酯對SREBP-1c基因表達(dá)的抑制作用，同時削弱對PPARα基因表達(dá)的上調(diào)作用(圖4B)。Western blot檢測結(jié)果顯示，BML-275在蛋白水平也產(chǎn)生相似的作用(圖4C)。上述結(jié)果表明，木香烴內(nèi)酯依賴于激活A(yù)MPK調(diào)控肝細(xì)胞中脂質(zhì)調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。

4 討論

長期過量攝入酒精，肝臟無法將其完全代謝，將導(dǎo)致體內(nèi)諸多生理、生化和代謝平衡失調(diào)，造成肝細(xì)胞損傷，進(jìn)而引發(fā)酒精性肝臟疾病的發(fā)生。酒精性脂肪肝發(fā)展為肝纖維化和肝硬化的危險性比單純性脂肪肝更高。一方面，酒精在肝臟通過CYP2E1代謝產(chǎn)生活性氧自由基，引起脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，在肝臟內(nèi)生成脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，造成肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡或壞死；另一方面，進(jìn)入肝細(xì)胞的酒精在乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶系的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰?，再轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜幔笠环磻?yīng)使氧化型輔酶I

圖4 木香烴內(nèi)酯通過激活A(yù)MPK調(diào)控肝細(xì)胞中脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)Fig.4 Activation of AMPK is required for costunolide to regulate the expression of lipogenesis-related transcription factors in hepatocytes注：(A)Western blot檢測木香烴內(nèi)酯對乙醇刺激的LO2細(xì)胞中AMPK磷酸化的影響，與對照組相比，**P<0.01，與乙醇組相比，##P<0.01；(B)Real-time PCR檢測木香烴內(nèi)酯及其與BML-275聯(lián)用時對乙醇刺激的LO2細(xì)胞中SREBP-1c、PPARα的mRNA表達(dá)的影響，與對照組相比，**P<0.01，與乙醇組相比，##P<0.01，與木香烴內(nèi)酯組相比，&P<0.05；(C)Western blot檢測木香烴內(nèi)酯及其與BML-275聯(lián)用時對乙醇刺激的LO2細(xì)胞中SREBP-1c、PPARα的蛋白表達(dá)的影響，與對照組相比，**P<0.01，與乙醇組相比，##P<0.01，與木香烴內(nèi)酯組相比，&&P<0.01。Note:(A) Western blot analyses for evaluating the effects of costunolide on AMPK phosphorylation in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide,*P<0.05 vs control,##P<0.01 vs ethanol;(B) Real-time PCR analyses for evaluating the effects of costunolide on mRNA expression of SREBP-1c and PPARα in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide and/or BML-275,**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs ethanol,&P<0.05 vs costunolide;(C) Western blot analyses for evaluating the effects of costunolide on protein expression of SREBP-1c and PPARα in ethanol-stimulated LO2 cells treated with costunolide and/or BML-275,**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs ethanol,&&P<0.01 vs costunolide.

(NAD)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型輔酶I(NADH)，因而NADH與NAD比值升高。NADH/NAD比值的升高可抑制細(xì)胞線粒體內(nèi)的三羧酸循環(huán)，使肝內(nèi)脂肪酸代謝發(fā)生障礙，氧化分解減弱，從而導(dǎo)致脂肪堆積于肝細(xì)胞中；另外，NADH/NAD比值的升高促進(jìn)了脂肪酸的合成，也導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞中堆積，最終導(dǎo)致了脂肪肝形成[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，乙醇在100 mM濃度下對人LO2肝細(xì)胞作用48 h可以顯著抑制肝細(xì)胞的活力，促進(jìn)轉(zhuǎn)氨酶的釋放，并增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)成分的生成與集聚，提示形成了酒精體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷與脂肪變性的模型，這一模型可用于考察藥物體外對酒精性脂肪肝的干預(yù)作用。

木香烴內(nèi)酯是一個受到廣泛關(guān)注的藥用天然產(chǎn)物。早先有研究發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯能夠抑制機(jī)體胃腸道對酒精的吸收，提示對酒精導(dǎo)致的肝損傷有潛在的保護(hù)作用[9]。越來越多的證據(jù)表明木香烴內(nèi)酯對肝臟具有多種藥理作用，如通過阻斷NF-κB信號通路改善急性肝損傷[4]，抑制肝細(xì)胞表達(dá)乙肝病毒表面抗原[10]，抑制肝臟中的氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]，以及阻斷肝癌細(xì)胞的周期進(jìn)而抑制其增殖[12]。據(jù)此，本論文旨在探討木香烴內(nèi)酯對酒精性脂肪肝的潛在干預(yù)作用與機(jī)制，發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯體外對正常肝細(xì)胞活力沒有顯著影響，但可以顯著改善酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷以及脂質(zhì)成分的合成，尤其是降低細(xì)胞內(nèi)TG和TC水平的升高。肝臟是合成和貯存TG和TC的主要器官。脂肪性肝病以肝細(xì)胞內(nèi)TG和TC蓄積過多和彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性為主要病理特征。在酒精性脂肪肝進(jìn)程中，乙醇聯(lián)合游離脂肪酸能夠降低線粒體脂肪酸β氧化能力，使TG和TC大量沉積于肝臟[13]。因此，木香烴內(nèi)酯抑制肝細(xì)胞內(nèi)TG和TC生成的作用可能是其改善酒精性脂肪肝的重要途徑之一。

本研究進(jìn)一步從肝細(xì)胞脂質(zhì)成分轉(zhuǎn)錄調(diào)控的角度探討木香烴內(nèi)酯的作用機(jī)制。SREBP是調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，共分為三種SREBP亞型，它們在脂質(zhì)合成中各自起到不同的作用，其中SREBP-1c是肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控者，幾乎參與所有肝臟甘油三酯和脂肪酸合成基因的轉(zhuǎn)錄。SREBP-1c的過度表達(dá)將引起糖脂代謝的異常，使產(chǎn)脂量大幅提升，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟等非脂肪組織的脂質(zhì)積聚[14]。PPARα是一個主要在肝臟表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)脂肪酸β氧化及脂蛋白合成中相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)肝臟脂代謝，改善胰島素抵抗。PPARα的缺乏或低表達(dá)可以使肝臟脂質(zhì)的利用和脂肪酸的氧化發(fā)生障礙，導(dǎo)致肝臟甘油三酯沉積、糖脂代謝紊亂[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，PPARα的拮抗劑GW6471可加重糖尿病脂肪肝小鼠肝臟炎癥反應(yīng)，而PPARα的激動劑WY14643可提高糖尿病脂肪肝小鼠脂肪變性程度[16]。因此，SREBP-1c與PPARα二者在細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝方面產(chǎn)生相反的調(diào)控作用，并且存在相互關(guān)聯(lián)，如有研究發(fā)現(xiàn)PPARα可抑制SREBP-1c的活性，從而減少脂肪酸和TG的合成[17]。本論文研究發(fā)現(xiàn)在乙醇刺激的LO2細(xì)胞中，木香烴內(nèi)酯可顯著下調(diào)SREBP-1c的表達(dá)并恢復(fù)PPARα的表達(dá)，這一作用可能是木香烴內(nèi)酯抑制LO2細(xì)胞內(nèi)TG、TC等脂質(zhì)成分合成的上游事件。這些結(jié)果也提示木香烴內(nèi)酯可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)生成。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯的作用依賴于激活A(yù)MPK。AMPK是廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合體，在應(yīng)激情況下，AMPK 磷酸化后激活，通過限制合成代謝減少ATP的消耗和促進(jìn)分解代謝增加ATP的生成來維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)[18]。本研究結(jié)果提示木香烴內(nèi)酯減少乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量可能與激活A(yù)MPK，進(jìn)而影響脂質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)。后續(xù)工作將進(jìn)一步探究木香烴內(nèi)酯如何激活肝細(xì)胞中的AMPK。

綜合本研究的結(jié)果表明，木香烴內(nèi)酯可能通過激活A(yù)MPK，調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c與PPARα的表達(dá)，進(jìn)而減少肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)生成與集聚。這一發(fā)現(xiàn)為木香烴內(nèi)酯作為酒精性脂肪肝的潛在防治藥物的進(jìn)一步研究提供實驗依據(jù)。