大鼠腰椎間盤突出癥造模前后大腦靜息態(tài)功能磁共振局部一致性變化研究

張燕鵬，梁鐘鳴，張傳寅

(上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院(復(fù)旦大學(xué)附屬華山北院寶山分院) 骨科，上海 201900)

腰椎間盤突出癥(Lumbar disc herniation，LDH)是指腰椎間盤發(fā)生退行性改變后，纖維環(huán)部分或全部破裂、單獨或者連同髓核、軟骨終板向外突出，刺激或壓迫竇椎神經(jīng)和神經(jīng)根引起的腰腿痛為主要癥狀的一種病變[1]。它是骨科一種常見的臨床疾病，也是引起腰腿痛的最常見原因。既往研究表明，周圍神經(jīng)受到損害時，大腦的功能和結(jié)構(gòu)都可能發(fā)生相應(yīng)的變化[2,3]。尤其與神經(jīng)痛相關(guān)性腦功能變化也與疼痛的時間和程度具有相關(guān)性[4-7]。同時，除了與周圍神經(jīng)損害直接相關(guān)的感覺運動區(qū)，與疼痛、記憶、情緒等相關(guān)的腦區(qū)，如內(nèi)側(cè)前額葉(mPFC)、前扣帶回(ACC)和島葉皮質(zhì)(Insular cortices)等也會發(fā)生改變[8,9]。目前已有一些對于LDH的腦功能研究[10-14]，但主要集中在LDH病人與健康人的對比，以及針灸、推拿等非侵入式干預(yù)方法對腦功能的影響。本研究建立LDH的大鼠模型，通過行為學(xué)檢測、小動物fMRI方法，對比在LDH造模前后的行為學(xué)和靜息態(tài)fMRI指標變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

雄性健康SD大鼠16只，體重200-250 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)條件：明暗光照12 小時周期循環(huán)，常規(guī)食物、飲水供應(yīng)，室溫控制在18℃，濕度40%-50%。所有的實驗均在研究開始前通過復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院寶山分院倫理委員會批準。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機等分組為2組：LDH組(n=8)和假手術(shù)組(n=8)。

1.2 造模方法

1.2.1腰椎間盤突出癥(LDH組) 實驗組以背部L5/L6椎間隙為中心，做背部正中縱形切口，依次切開皮膚、皮下組織及腰背筋膜，沿棘突左側(cè)剝離骶棘肌，并向左側(cè)分開，顯露左側(cè)L5、L6椎板，咬除L5、L6左側(cè)椎板、關(guān)節(jié)突和部分椎弓根，顯露左側(cè)硬脊膜及L5、L6的左側(cè)神經(jīng)根、神經(jīng)節(jié)。再在大鼠尾腹側(cè)近根部縱行切開皮膚、皮下組織至尾椎骨面，向兩側(cè)分離顯露兩個椎間隙，取出兩段髓核組織并分別移植到L5、L6神經(jīng)根處，逐層縫合傷口，送至動物房正常飼養(yǎng)[15-18]。

1.2.2假手術(shù)組(Sham組) 假手術(shù)組大鼠單純暴露L5、L6神經(jīng)根，切除尾椎髓核后，逐層縫合傷口，送至同等環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.3 行為學(xué)檢測方法

分別在造模前1天和造模后2、7、14、28天檢測大鼠左側(cè)(患側(cè))后肢的機械性痛閾、熱痛閾和步態(tài)分析。

1.3.1機械性痛閾檢測 采用Von-Frey纖維絲(美國Stoelting公司)，垂直刺激大鼠左后肢足底。漸加壓使纖維成為“S”形,持續(xù)6-8 s，觀察大鼠是否出現(xiàn)縮足反應(yīng)。若大鼠在刺激時或移開von Frey 纖維時立刻出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，即為陽性反應(yīng)。出現(xiàn)陽性50%以上則定為對機械刺激的痛反射閾值(g)。

1.3.2熱痛閾檢測 熱痛閾用于評估溫度覺，采用熱痛儀(PL-200，II TC/life Science公司，USA)檢測。其結(jié)果為從開始熱刺激到大鼠縮足的時間，即大鼠熱縮足反應(yīng)潛伏期(s)，進行量化分析，評估感覺神經(jīng)功能。

1.3.3雙足平衡試驗 采用PH-200雙足平衡測試系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)檢測大鼠平靜狀態(tài)下雙側(cè)后足的負重情況。記錄雙側(cè)后肢的負重差。

1.4 小動物fMRI掃描方法

采用德國Bruker 7.0 T磁共振系統(tǒng)小動物專用線圈，在造模前1天和造模后28天分別進行一次靜息態(tài)大腦fMRI掃描。大鼠4%異氟烷氣麻后固定在MRI掃描儀，2%異氟烷維持麻醉，給予呼吸機支持和呼吸監(jiān)測。首先掃描T2加權(quán)像序列以進行解剖定位，具體參數(shù)為：TR=4000 ms，TE=18 ms，平均次數(shù)2，翻轉(zhuǎn)角為90°，F(xiàn)OV=10×10 mm2，層厚為=3 mm。靜息態(tài)fMRI采用隔層掃描的單激發(fā)平面回波序列(Echo planar imaging，EPI)，翻轉(zhuǎn)角=90°，掃描層厚=3 mm，平均次數(shù)1，層數(shù)60層，TR=3000 ms，TE=20 ms，F(xiàn)OV=32×32 mm2。

數(shù)據(jù)處理和分析采用Matlab 2013a環(huán)境下的Statistical Parametric Mapping 8(SPM8)軟件包(http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/)。在開始處理時，圖像進行十倍放大，使其尺寸近似人類的大腦，以便于使用原本為人類研究開發(fā)的數(shù)據(jù)處理算法。

預(yù)處理包括以下7個步驟：①剝除非腦組織；②時間層校正；③頭動校正；④空間標準化；⑤去線性漂移；⑥濾波(0.01-0.08Hz)；⑦去除協(xié)變量，包括頭動參數(shù)、全局平均信號、白質(zhì)和腦脊液信號。

局部一致性(Regional homogeneity，ReHo)的計算：ReHo用于分析局部腦活動的特性，該方法是利用肯德爾和諧系數(shù)(Kendall coefficient of concordance，KCC)來評價一個體素與相鄰體素腦活動的一致性[19]。ReHo 分析采用未進行高斯平滑的數(shù)據(jù)。運用北京師范大學(xué)研發(fā)的腦功能數(shù)據(jù)處理軟件REST計算出各個體素的KCC，即為各個體素的ReHo值。ReHo值越大，提示給定體素的靜息狀態(tài)時間序列與其周圍的26個體素的時間序列具有較高的區(qū)域同步性。全腦每個體素的ReHo值構(gòu)成了個體ReHo腦圖。把每一個體素KCC值除以全腦平均KCC值得到個體的平均ReHo圖像。然后對平均ReHo腦圖進行高斯平滑(平滑核為體素大小兩倍)。

1.5 統(tǒng)計方法

1.5.1行為學(xué)統(tǒng)計方法 行為學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗。P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。

1.5.2fMRI統(tǒng)計方法 fMRI數(shù)據(jù)采用SPM8進行統(tǒng)計分析。為了確定每個時間點2組之間的差異，對同一組的兩個時間點之間比較進行雙樣本t檢驗。采用FDR(False Discovery Rate)校正(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測結(jié)果

2.1.1機械性痛閾 造模前LDH組和Sham組左側(cè)(患側(cè))后足機械性痛閾無顯著差異。造模后2天開始LDH組機械性痛閾較造模前顯著下降(P<0.05)，一直持續(xù)到造模后28天；Sham組造模后機械性痛閾稍有下降，但與造模前比沒有顯著差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 腰椎間盤突出癥組與假手術(shù)組大鼠造模前與造模后2、7、14、28天左后足機械性痛閾變化情況(*表示與該組造模前比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05)

2.1.2熱痛閾 造模前LDH組和Sham組左側(cè)(患側(cè))后足熱痛閾無顯著差異。造模后2天開始LDH組熱痛閾較造模前顯著下降(P<0.05)，一直持續(xù)到造模后28天；Sham組造模后熱痛閾稍有下降，但與造模前比沒有顯著差異(P>0.05)(圖2)。

2.1.3雙足平衡試驗 造模前LDH組和Sham組雙后足負重差無顯著差異。造模后2天開始LDH組雙后足負重差較造模前顯著增加(P<0.05)，一直持續(xù)到造模后28天；Sham組造模后雙足負重差稍有增加，但與造模前比沒有顯著差異(P>0.05)(圖3)。

2.2 小動物fMRI結(jié)果

術(shù)后28天LDH組大鼠右側(cè)大腦半球體感皮質(zhì)、運動皮質(zhì)等感覺運動整合相關(guān)腦區(qū)ReHo較造模前顯著降低；右側(cè)丘腦背外側(cè)、左側(cè)海馬背外側(cè)ReHo值顯著增加(P<0.05，F(xiàn)DR校正，cluster size≥10)(圖4)。術(shù)后28天Sham組大鼠ReHo值未發(fā)生顯著改變。

圖2 腰椎間盤突出癥組與假手術(shù)組大鼠造模前與造模后2、7、14、28天左后足熱痛閾變化情況(*表示與該組造模前比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05)

圖3 腰椎間盤突出癥組與假手術(shù)組大鼠造模前與造模后2、7、14、28天雙足負重差變化情況(*表示與該組造模前比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05)

圖4 腰椎間盤突出癥組(LDH組)大鼠造模后28天與造模前相比局部一致性(ReHo)變化情況

3 討論

腰椎間盤突出癥所致腰腿痛是骨科最常見的疾病之一，近年來不僅中老年人，很多年輕人也罹患此病，其發(fā)病率占椎管疾病的第一位。手術(shù)治療是較徹底的干預(yù)手段，但仍有部分患者術(shù)后癥狀未完全緩解。目前認為，周圍和中樞神經(jīng)為一個整體，周圍神經(jīng)損傷，如卡壓、挫傷、完全或部分斷裂等，會引起大腦功能甚至結(jié)構(gòu)的改變。因此，研究LDH發(fā)生過程中大腦功能狀態(tài)對于全面了解LDH對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響具有重要價值。

功能磁共振(fMRI)是研究腦功能的重要無創(chuàng)、非侵入式工具之一，它可以動態(tài)檢測個體干預(yù)前后大腦的微小變化[20,21]。ReHo是一種基于靜息狀態(tài)fMRI數(shù)據(jù)的分析方法[19]，采用KCC為指標來度量一個團塊(常為27個體素)內(nèi)一個體素與其相鄰體素之間低頻振幅的時域同步性。fMRI也用于多項LDH臨床研究[10-14]。張川等發(fā)現(xiàn)，LDH所致疼痛引起廣泛的腦功能區(qū)低頻振幅(ALFF)異常，包括疼痛、感覺、運動、情緒、記憶、認知等，并與疼痛程度呈正相關(guān)[10]。劉宜軍等也將fMRI用于LDH的腦功能研究，發(fā)現(xiàn)針刺、手法治療的鎮(zhèn)痛效應(yīng)相關(guān)的靜息態(tài)腦功能變化[11,12,14,22,23]。但這些研究多為患者和健康人之間的對比，而較難進行LDH發(fā)生、發(fā)展過程中腦功能變化；且基于不同被試組之間的比較，混雜因素較多，結(jié)果的可靠性可能受到影響。隨著技術(shù)的發(fā)展，尤其是高場強MRI和小動物專用線圈的出現(xiàn)，我們有可能對動物的腦功能進行動態(tài)檢測。

本研究對大鼠在L5/L6腰椎間盤突出癥造模前后的行為學(xué)和腦功能進行動態(tài)檢測(LDH組)，設(shè)置假手術(shù)組(Sham組)進行對照。行為學(xué)檢測結(jié)果顯示， LDH組大鼠左側(cè)后足機械性痛閾和熱痛閾顯著下降，雙后足的負重差顯著升高、且右側(cè)(健側(cè))負重大于左側(cè)(患側(cè))，顯示LDH造模成功。

本研究中靜息態(tài)磁共振檢測顯示，LDH組大鼠造模后多個腦區(qū)的ReHo值發(fā)生改變，包括右側(cè)大腦半球(患肢對側(cè))的感覺運動相關(guān)腦區(qū)，如體感皮質(zhì)、運動皮質(zhì)等的ReHo較造模前顯著降低。這與周圍神經(jīng)卡壓的模型相似。既往對腕管綜合征(腕部正中神經(jīng)卡壓)的fMRI研究提示，腕管綜合征患者對側(cè)半球初級感覺運動皮質(zhì)的正中神經(jīng)代表區(qū)出現(xiàn)比正常對照組激活范圍更大，且示、中指初級感覺區(qū)(S1)比正常對照組激活范圍更大、距離更接近[24]。在感覺刺激任務(wù)中，腕管綜合征患者患肢對側(cè)初級感覺區(qū)(S1)和雙側(cè)刺激感覺區(qū)(S2)、初級運動區(qū)(M1)、運動前區(qū)(PMC)、島葉皮質(zhì)(Insular cortex)激活范圍更大、重疊更多[25]。在周圍神經(jīng)卡壓時，神經(jīng)的傳入和傳出都受阻，患肢所對應(yīng)的感覺運動功能區(qū)內(nèi)部聯(lián)系減弱，相應(yīng)感覺運動功能區(qū)的完整性受損。

此外，本研究還顯示LDH組右側(cè)背外側(cè)丘腦、左側(cè)海馬背外側(cè)ReHo值較造模前顯著增加。丘腦是重要的感覺傳導(dǎo)接替站，并與基底神經(jīng)節(jié)、小腦、新皮質(zhì)以及內(nèi)側(cè)顳葉建立雙向的信息傳導(dǎo)。來自全身各種感覺的傳導(dǎo)通路，均在丘腦內(nèi)更換神經(jīng)元，然后投射到大腦皮質(zhì)。海馬(Hippocampus)主要負責(zé)學(xué)習(xí)和記憶。當(dāng)大腦皮質(zhì)中的神經(jīng)元接收到感知信息時，會把信息傳遞到海馬，開始形成持久的網(wǎng)絡(luò)，大腦通過這種形式保存記憶和經(jīng)驗。丘腦與海馬ReHo值增加表明與疼痛信息傳導(dǎo)、感覺記憶的相關(guān)區(qū)域局部同步性增強，功能一致性增加。因此，我們推測，丘腦和海馬ReHo值改變與神經(jīng)根受刺激引起的疼痛信號，局部效應(yīng)匯集，發(fā)生相互作用所致。

綜上所述，通過ReHo值能夠研究與感覺和疼痛相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)活動的局部同步性發(fā)生改變，這為我們進一步動態(tài)研究LDH作用機制和前后變化提供了重要幫助。