DCC基因?qū)β闶笃は陆Y(jié)直腸腫瘤的生長和淋巴管生成的影響

套格蘇,王 舉,胡 琦，姜洪偉*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學研究生學院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 胃腸外科)

DCC基因是由Fearon等[1]研究結(jié)直腸腫瘤時用定位克隆的方法確定并命名的一個腫瘤抑制基因，其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與神經(jīng)細胞黏附分子有明顯的同源性。研究發(fā)現(xiàn)DCC轉(zhuǎn)錄物在結(jié)直腸腫瘤組織中顯著降低，在增殖性息肉上皮細胞中DCC蛋白表達十分明顯，而在被認為是結(jié)直腸癌前體的具有明顯不典型增生的晚期腺瘤中卻未見明顯DCC表達[2]。還有學者認為DCC基因失活可能是影響大腸癌預后的重要因素之一，肝轉(zhuǎn)移者發(fā)生DCC表達失活的主要機制是發(fā)生了基因突變[3]。本研究通過獲取基因片段，將目的基因插入到表達載體，并將人結(jié)直腸癌SW1116細胞懸液注射到裸鼠皮下，使裸鼠成瘤后進行相關(guān)的干預，再對相關(guān)指標進行測量，最后進行進一步分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物BALB/C雄性裸鼠15只購自上海斯萊克實驗動物有限公司。動物品系為無特定病原體BALB/C裸鼠，雄性，6-8周。聚合酶鏈反應(PCR)管、PCR儀等。

1.2 實驗方法

①通過基因合成方法獲得帶有DCC功能區(qū)的亞克隆質(zhì)粒，通過金唯智基因合成獲得目的片段。將目的基因插入到表達載體,即將提取的質(zhì)粒pUC57-DCC與載體pCDNA3.1通過HindIII和XbaI雙酶切系統(tǒng)進行酶切鏈接。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，小量提取質(zhì)粒。酶切鑒定并大量提取質(zhì)粒，將提取的兩個質(zhì)粒進行酶切鑒定。②人結(jié)直腸癌SW1116細胞培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液，37℃5%CO2恒溫恒濕的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對已經(jīng)長滿的細胞，棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液漂洗一次，加入胰酶消化液，37 ℃孵育，待細胞完全脫落，加完全培養(yǎng)基中和胰酶，離心6 min(1 000 r/min，離心半徑為10 cm)，棄上清。無血清培養(yǎng)基洗2次，加5 ml無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)。用無血清培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)至1×107個/ml。③將裸鼠在無特定病原體動物房飼養(yǎng)，自由飲食和飲水，適應性飼養(yǎng)7 d。第7天將SW1116細胞懸液注射到裸鼠皮下，每只小鼠注射0.2 ml。④建模第15天，觀察裸鼠成瘤情況，測量腫瘤大小。將裸鼠隨機分為3組(15只體重、年齡相等雄性裸鼠)，對裸鼠進行如下干預實驗：第1組：生理鹽水組(n=5，腹腔注射生理鹽水)；第2組：DCC干預治療組(n=5，瘤體內(nèi)多點注射DCC質(zhì)粒，注射50 μg，質(zhì)粒濃度908 ng/μl)；第3組：5-氟尿嘧啶(5-FU)治療組(20 mg/kg體重，腹腔注射，連續(xù)15 d)。⑤經(jīng)上述干預處理后，每周用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長與寬，稱量裸鼠體重，計算抑制瘤率；造模第30天處死裸鼠[由于給藥后第15天瘤體無明顯差異，因此多飼養(yǎng)了1周，即給藥后第22天(造模后第30天)取樣檢測]，剝離腫瘤，稱重，拍照，計算抑瘤率。抑瘤率=(1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

1.3 檢測相關(guān)指標

1.3.1細胞凋亡檢測 取1-2 mm大小的腫瘤組織，然后加入5-10倍體積的胰酶，37 ℃消化7 min，用5 ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，過濾得到細胞懸液，將細胞懸液離心6 min(1 000轉(zhuǎn)r/min，離心半徑為10 cm)，得到腫瘤單細胞。后將細胞用磷酸緩沖鹽溶液洗1次后，重懸于1×結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)中(將10×Binding Buffer用蒸餾水稀釋)。其中對照用400 μl 1×Binding Buffer，其他處理組用100 μl 1×Binding Buffer。每管加5 μl 磷脂結(jié)合蛋白(FITC-Annexin V)和5 μl碘化丙啶(50 μg/ml)。輕柔彈起混勻，室溫(25 ℃)避光孵育15 min。加400 μl 1×Binding Buffer至每管中，混勻。1 h內(nèi)上流式分析軟件分析實驗數(shù)據(jù)。

1.3.2Western blotting檢測 ①蛋白樣品的處理與定量：用BCA法檢測細胞裂解液的蛋白濃度，測好濃度的蛋白分裝放于-80℃保存。②聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

1.3.3淋巴管計數(shù)標準 參照Weidner法進行淋巴管計數(shù)，在低倍顯微鏡(×100)下觀察全切片淋巴管分布情況后，選擇淋巴管密集的3個區(qū)域，以高倍顯微鏡(×200)計數(shù)每個區(qū)域的淋巴管數(shù)量，以3個區(qū)域平均值為該標本的淋巴管密度。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)應用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法。計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 目的基因插入到表達載體

將提取的質(zhì)粒pUC57-DCC和載體pCDNA3.1通過HindIII和XbaI雙酶切系統(tǒng)進行酶切。雙酶切鑒定可觀察到在300 bp處有特異性條帶。雙酶切和質(zhì)粒測序結(jié)果表明pCDNA3.1-DCC中含有序列正確的DCC基因。見圖1、圖2。

2.2 對裸鼠瘤重的影響

生理鹽水組、DCC干預治療組、5-FU治療組裸鼠的腫瘤重量分別為(0.353±0.119)g、(0.123±0.015)g、(0.147±0.041)g，差異具有統(tǒng)計學意義(F=8.903，P=0.016)；進一步兩兩比較結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，DCC干預治療組、5-FU治療組裸鼠腫瘤重量均有所減輕，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但DCC干預治療組與5-FU治療組相比，瘤重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 細胞凋亡實驗結(jié)果

3組不同干預措施對裸鼠腫瘤細胞凋亡率的影響，經(jīng)χ2檢驗結(jié)果顯示，3組裸鼠的腫瘤細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.362，P=0.000)。與生理鹽水組相比，DCC干預治療組、5-FU治療組總凋亡率均升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.4 轉(zhuǎn)染后DCC蛋白的表達

轉(zhuǎn)染后，Western blotting檢測可以發(fā)現(xiàn)，曝光900秒掃膜未檢測到條帶，已重復3次，均未檢測到DCC蛋白，見圖3。可能與DCC蛋白的表達量特別低，信號較弱有關(guān)。

表1 3組不同干預措施對腫瘤細胞凋亡率的影響(%)

注：5-FU為5-氟尿嘧啶；a為與生理鹽水組比較，P<0.05

注：1為Marker；2、3為pUC57-DCC；4、5 注：1為Marker；2、3為pCDNA3.1-DCC為pCDNA3.1 注：1、2為生理鹽水組；3、4為DCC干預治療組；5、6為5-FU治療組；5-FU為5-氟尿嘧啶

圖1 pUC57-DCC和pCDNA3.1(+)圖2 質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖 圖3 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后DCC蛋白的表達酶切電泳圖

生理鹽水組、DCC干預治療組、5-FU治療組的DCC蛋白表達分別為1.556±0.088、2.061±0.075和2.052±0.114，差異有統(tǒng)計學意義(F=28.427，P=0.001)。與生理鹽水組相比，DCC干預治療組、5-FU治療組的DCC蛋白表達量均增加(均P<0.001)。

2.5 淋巴管計數(shù)結(jié)果

生理鹽水組、DCC干預治療組、5-FU治療組的淋巴管計數(shù)情況分別是(14.67±0.626)個、(8.43±1.002)個、(7.49±0.514)個，差異有統(tǒng)計學意義(F=6.489，P=0.039)。與生理鹽水組相比，DCC干預治療組、5-FU治療組裸鼠的淋巴管數(shù)量均減少，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

3 討論

DCC基因位于人體染色體18q21.3，含有1.4 Mbp和29個外顯子。其表達蛋白是I型跨膜蛋白，由1 447個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為190 000。DCC蛋白參與細胞之間、細胞與基質(zhì)之間的相互作用，使細胞維持正常的生長和分化方式。當DCC基因發(fā)生缺失和突變后，DCC蛋白生成障礙，細胞的生長和分化紊亂促使細胞朝著惡性方向演變。DCC基因在絕大多數(shù)正常組織中均有表達，但在大多數(shù)結(jié)直腸癌組織中的表達卻有下調(diào)趨勢。DCC基因抑癌的機制與其能夠誘導細胞凋亡有關(guān)。作為依賴性受體，當配體Netrin-1存在時，DCC與其結(jié)合對細胞凋亡起到抑制作用，但當細胞缺乏Netrin-1配體時，DCC則誘導細胞凋亡。

DCC基因的胞內(nèi)功能域(3 727-3 792 bp)具有誘導結(jié)腸癌細胞凋亡的作用[4]。DCC基因改變是癌變發(fā)生過程中的早期基因事件，其缺失或失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個促發(fā)因素。DCC蛋白的表達缺失與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移及細胞分化相關(guān)[5]。研究者發(fā)現(xiàn)大腸癌中DCC表達缺失頻率較高，可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達和下調(diào)Bax蛋白表達阻止細胞凋亡，從而促進大腸癌的發(fā)生[6]。

Itoh等[7]研究了人結(jié)直腸癌中DCC mRNA的表達量，結(jié)果顯示與非癌組織相比，30例結(jié)直腸癌中的17例存在DCC mRNA低表達，且結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的4個標本均表現(xiàn)為DCC mRNA的表達水平下降，該研究結(jié)果表明，DCC的功能性喪失，有可能是癌癥轉(zhuǎn)移的重要機制之一。

DCC基因的表達缺失可作為判斷大腸癌轉(zhuǎn)移潛能及預后的獨立指標[8]。大腸癌組織中確實存在DCC蛋白表達缺失，且與大腸癌患者Dukes分期有關(guān)；大腸癌組織中存在高頻率DCC基因啟動子甲基化的發(fā)生，且與直腸癌的關(guān)系更為密切；DCC基因啟動子甲基化可能是大腸癌中DCC失表達的主要機制之一。轉(zhuǎn)染的DCC基因可以抑制細胞增殖，導致癌胚抗原在SW1116細胞中表達下調(diào)，從而降低其浸潤和轉(zhuǎn)移能力[9]。

腫瘤抑制基因的存在主要是由3個方面提出的：一是通過與正常細胞雜交抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化表型；二是多種腫瘤的染色體缺失；三是腫瘤細胞特異染色體區(qū)域雜合性缺失。許多研究結(jié)果支持多種腫瘤抑制基因的劑量丟失或改變在廣泛的癌癥發(fā)生和(或)進展中起關(guān)鍵作用[10]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，DCC表達較高，是軸突導向和神經(jīng)元遷移的關(guān)鍵因子。最近，細胞培養(yǎng)實驗表明，Netrin-1和DCC是體細胞重編程的調(diào)節(jié)器[11]。

DCC誘導細胞凋亡的喪失也與結(jié)直腸腫瘤的數(shù)量和侵襲性有關(guān)，在誘發(fā)抑癌基因突變的背景下，導致高度浸潤性腺癌的發(fā)展。這些研究表明，DCC作為一個腫瘤抑制劑可通過其能力觸發(fā)腫瘤細胞凋亡[12]。

本研究采用PCDNA3.1(+)-DCC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染15例皮下結(jié)直腸腫瘤裸鼠后，檢測了DCC蛋白表達情況，結(jié)果表明DCC蛋白表達量降低，在3次Western blotting檢測中均未發(fā)現(xiàn)條帶(DCC蛋白)，說明在結(jié)直腸癌中DCC基因失表達。此外，癌組織中測得淋巴管的數(shù)量也顯著減少。更有說服力的指標是DCC干預治療組裸鼠的瘤重明顯小于生理鹽水組。研究結(jié)果還顯示，與生理鹽水組比較，DCC組總凋亡率有升高，說明DCC基因可誘導細胞凋亡，并可通過誘導細胞凋亡來抑制裸鼠皮下結(jié)直腸癌癌細胞的生長和增殖。

綜上，DCC基因能夠抑制結(jié)直腸腫瘤的生長和淋巴管的生成，且抑癌機制與其能夠誘導細胞凋亡有關(guān)。目前對DCC基因的研究有了很大的進步，但是關(guān)于DCC基因的失活機制、DCC基因與其他基因是如何協(xié)同作用于結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，如何誘導細胞分化等有待進一步研究。