血清miR-223、IL-8聯(lián)合檢測在骨肉瘤診斷中的應(yīng)用

張 健,王金有,劉澤華,范洪武,梁鉑堅，呂佳音

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)與運動醫(yī)學(xué)科,吉林 長春130033)

骨肉瘤為惡性程度較高骨腫瘤,臨床上常見,目前發(fā)病年齡具有年輕化的趨勢,10歲-25歲為該疾病的主要發(fā)病年齡段,年發(fā)病率可達3/100萬。早期轉(zhuǎn)移是該疾病的特點,約50%的患者在開始診治時已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。侵襲轉(zhuǎn)移和遠處血行轉(zhuǎn)移為主要的播散方式。最常見的轉(zhuǎn)移臟器為肺部轉(zhuǎn)移,因早期無明顯的臨床癥狀,出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移后5年生存率在30%以下。因此在早期診斷是提高生存率的重要方式。微小RNA(miRNA)是具有調(diào)控功能的非編碼RNA,不同功能miRNA作用于不同的靶向基因,調(diào)控基因的表達。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,miRNA發(fā)揮重要的調(diào)控作用。IL-8是能夠趨化誘導(dǎo)中性粒細胞的炎性介質(zhì),促進炎癥反應(yīng)的過程。近來研究發(fā)現(xiàn),其在多種腫瘤中呈高表達狀態(tài)[1]。本次研究血清 miR-223在骨肉瘤患者中的表達及臨床意義,探究血清IL-8與miR-223聯(lián)合檢測應(yīng)用于骨肉瘤早期診斷的臨床價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年9月至2018年6月我院及協(xié)作醫(yī)院收治的骨肉瘤患者38例(男12例,女26例,年齡15.45±4.20歲),均行根治性骨肉瘤切除術(shù),收集骨肉瘤組織。病例納入標(biāo)準：①骨肉瘤的診斷參考《SEOM clinical guidelines for the treatment of osteosarcoma in adults》[2]；②臨床資料準確且完整,未進行放療或者化療。③由2名病理醫(yī)師確定病理診斷。另選取同期健康體檢者38例(男16例,女22例,年齡17.89±4.93歲)進行對照研究,所有參與者簽署知情同意書,同時排除具有可能影響檢測結(jié)果合并其他疾病的患者。

1.2 檢測方法

①實時熒光定量PCR檢測miR-223的含量。各稱取50 mg腫瘤組織以及癌旁組織,液氮研磨,提取總RNA(Trizol)；RNA核酸定量儀定量并保存于-80℃的環(huán)境下。采用北京博奧森生物技術(shù)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒,按要求配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。qRT-PCR采用miScrpt SYBR Green PCR kit方法檢測,并按照操作要求配制反應(yīng)體系。miR-2的上游引物序列為5’-CATGGCATCTGTCTGGCTGCC-3’下游引物5’-AACTCTTGCAATTTGGTC-3’；內(nèi)參U6上游引物序列5’-CTCGCTGGCAGACAGAC-3’,下游引物序列5’-AACGCTTGACATGGGAAAT-3’,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。95℃條件下預(yù)變性5 min,95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s,共進行40個循環(huán)變性和延伸后收集。反應(yīng)條件：78℃ 20 s。采用2-△△Ct計算相對基因表達量。②ELISA檢測血清IL-8的含量。空腹采取肘部靜脈血5 ml,離心去上清,按照試劑盒操作說明書進行檢測,試劑盒購自上海寶龍生物科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 血清中miR-223和IL-8在兩組中的表達

骨肉瘤組的血清miR-223表達明顯降低,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。骨肉瘤組的血清IL-8的表達明顯高于對照組,組間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示,二者之間呈低度相關(guān)(r=0.318,P<0.05)。

2．2 骨肉瘤組miR-223和IL-8的表達與相關(guān)因素關(guān)系

分析骨肉瘤患者的臨床因素,結(jié)果顯示,miR-223和IL-8的表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤組織類型無關(guān),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而不同轉(zhuǎn)移情況的患者的miR-223和IL-8表達量組間均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表1 骨肉瘤組與對照組的miR-223與IL-8的 表達

表2 骨肉瘤組織miR-223和IL-8的表達與臨床病理的 相關(guān)分析

*P<0.05**P<0.01

2.3 ROC曲線分析特異度和敏感度

圖1所見,采用 SPSS 21.0 繪制ROC的曲線圖顯示,miR-223、IL-8以及二者聯(lián)合的曲線下面積(AUC)分別為0.900、0.763、0.937,提示二者聯(lián)合檢測的效能可能高于miR-223和IL-8單一檢測(P<0.05)。以約登指數(shù)(敏感度+特異度-100%)最大為原則,選擇最佳截斷值為診斷界值,得到敏感度及特異度，并計算準確度。見表3。

圖1 miR-223、IL-8以及二者聯(lián)合的ROC曲線分析

3 討論

骨肉瘤的診斷主要包括X線、CT、MRI等放射手段以及血清的堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶檢測,但由于骨肉瘤早期常無明顯的癥狀,故在常規(guī)體檢中很難發(fā)現(xiàn)骨肉瘤[3]。往往在出現(xiàn)臨床癥狀或者確診骨肉瘤時,大多患者已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,延誤醫(yī)治。因此,尋找敏感度高、特異度強的檢測方式具有重要的臨床意義。miRNA 在真核生物中廣泛存在,外周血清中性能穩(wěn)定且耐酶降解、耐酸、耐堿、耐低溫,因此為miRNA成為腫瘤標(biāo)志物用于檢測提供了必要的前提。研究顯示,miR-223在多種腫瘤中的表達出現(xiàn)異常[4,5]。在骨肉瘤的研究中,多個miRNA包括miR-7、miR-10b、miR-181、miR-190、miR-214等被認為參與了骨肉瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移[6],miR-223也是其中重要一員[7-10]。本次研究顯示,骨肉瘤組血清miR-223表達明顯降低,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)進一步對比臨床資料分析,miR-223表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤組織類型無關(guān),而不同轉(zhuǎn)移情況患者的miR-223表達量具有統(tǒng)計學(xué)差異,即miR-223在有腫瘤轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者中有更低的表達,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,這提示在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程中miR-223表達的下降可能是其關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。此前,Dong等人的研究也得出近似的結(jié)論,他們在研究中發(fā)現(xiàn),miR-223可以抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲,與miR-223高表達的患者相比,miR-223低表達患者的存活時間顯著縮短[11]。這可能意味著miR-223有望成為早期篩查和診斷骨肉瘤以及判斷預(yù)后的新的標(biāo)志物。

表3 血清miR-223和IL-8檢測骨肉瘤的敏感度和特異度

在腫瘤的生長過程中,炎性介質(zhì)同樣發(fā)揮了重要的作用[12,13]。如IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子參與了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。魯俊杰等的研究發(fā)現(xiàn),IL-8表達異常與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14],IL-8的高表達是骨肉瘤進展的重要依據(jù),對疾病的診斷以及病情的評估具有重要的價值[15]。劉濤等研究顯示,IL-8 在循環(huán)腫瘤細胞自我種植促進人骨肉瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用,可為骨肉瘤患者早期診斷和治療提供一個新的策略[16]。本次研究顯示,骨肉瘤組的血清IL-8的表達明顯高于對照組,組間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異。其表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤組織類型無關(guān),而在轉(zhuǎn)移情況上表達量的組內(nèi)比較具有統(tǒng)計學(xué)差異,這與上述報道一致。因此,IL-8也可作為骨肉瘤診斷的標(biāo)志物之一。

由于考慮到惡性腫瘤的檢測和診斷過程中,漏診可能導(dǎo)致的不良后果,我們按照“并聯(lián)”診斷的原則,即任一指標(biāo)為陽性者即診斷為陽性,以此來判斷聯(lián)合檢測的結(jié)果和價值,并同時對比分析了二者單獨檢測對骨肉瘤診斷的結(jié)果和價值。分析結(jié)果顯示miR-223、IL-8以及二者聯(lián)合的曲線下面積(AUC)分別為0.900、0.763、0.937。二者聯(lián)合檢測較任一單一檢測在敏感度上有了較大幅度的提升,而特異度僅有較小幅度的下降。這點在疑似骨肉瘤患者的早期篩查及診斷方面,有效地減少了漏診的幾率,對臨床腫瘤早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療具有重要的意義,但由于其偏低的特異度,我們認為在臨床實際應(yīng)用中,尚需要結(jié)合其他診斷方式進一步排查,避免誤診。由于本次研究的樣本數(shù)量有限,病患來源相對集中,miR-223診斷的準確性、miR-223與IL-8之間的相關(guān)性、聯(lián)合診斷的可靠性以及是否還有其他更具臨床價值的聯(lián)合檢測手段等還需更大樣本量進一步實驗證實。

本次研究表明,骨肉瘤患者血清miR-223表達下調(diào),與對照組具有統(tǒng)計學(xué)差異,有望成為骨肉瘤分子診斷的重要標(biāo)志物。miR-223和IL-8聯(lián)合檢測具有較高的敏感度,能夠有效減少漏診的幾率,提高臨床中對骨肉瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷能力,可能成為新的臨床篩查、診斷的有效手段,而且可能成為判斷骨肉瘤患者預(yù)后的一項有效指標(biāo)。