清除巨噬細(xì)胞加重葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎*

浦佩珉，卞兆連，包元飛，沈健豪，李 民△，顧爾莉

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)南通中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)院/南通市第三人民醫(yī)院肝病科/肝病研究所，江蘇南通 226000)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種以慢性炎性反應(yīng)和胃腸道上皮損傷為特征的自身免疫性腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)。雖然目前認(rèn)為該病的發(fā)生主要與飲食、基因及機(jī)體免疫等有關(guān)[1-4]，但是其具體的發(fā)病機(jī)制仍不明確。腸道巨噬細(xì)胞是腸黏膜抗原呈遞細(xì)胞的主要種群，它可能通過招募血中單核細(xì)胞進(jìn)入腸道，從而增加促炎因子白細(xì)胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)[5]。由于巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生促炎因子來調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，因此被認(rèn)為是IBD破壞性力量的一部分。但是，活化狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞也可以產(chǎn)生一些免疫抑制因子，可以幫助修復(fù)受損的腸道黏膜組織[6]，且亦有實(shí)驗(yàn)表明腸道巨噬細(xì)胞可以明顯抑制實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎[7]，主要通過巨噬細(xì)胞中的硒蛋白來保護(hù)小鼠免受炎癥侵犯[8]。為了研究巨噬細(xì)胞在IBD中的作用，本研究使用Clodrolip清除葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，以探討巨噬細(xì)胞在UC中的作用，為UC的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 野生型雄性6～8周齡C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量22～24 g，由南通大學(xué)動物中心提供，飼養(yǎng)在南通大學(xué)無特殊病原體(SPF)級動物房中。動物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守南通大學(xué)動物倫理委員會要求。

1.1.2試劑 Clodrolip(荷蘭Liposoma B.V.公司)；葡聚糖硫酸鈉鹽(美國MP公司)；人尿糞隱血測試盒(南京建成生物工程研究院)；Ki67抗體(德國Abcam公司)；兔二步法檢測試劑盒/兔增強(qiáng)聚合物法檢測系統(tǒng)(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)，內(nèi)含內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、反應(yīng)增強(qiáng)液、增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、粉劑型抗原修復(fù)液(檸檬酸法，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、蛋白酶K(德國Roche公司)，內(nèi)含Enzyme Solution、Label Solution、Converter-POD；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)引物，包括β-actin、IL-1β、IL-6、TNF-α、F4/80[生工生物工程(上海)股份有限公司]；TRlzol試劑、5×PrimeScript RT Master Mix、Prime Script RT Master ExTaqⅡ試劑盒、TB Green Premix ExTaq Ⅱ、RNase Free dH2O(美國TaKaRa公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠UC模型建立及巨噬細(xì)胞清除 小鼠UC模型的建立參考文獻(xiàn)[9]方法稍做修改。3% DSS用滅菌水配置后除菌過濾。將小鼠隨機(jī)分為兩組，每組5只，兩組均予以3% DSS飲用水飼養(yǎng)7 d(7×24 h),DSS+Clodrolip組于造模前3 d、造模當(dāng)天、造模第2、4、6天腹腔注射200 μL Clodrolip，用于清除小鼠體內(nèi)及再生的巨噬細(xì)胞。每天稱重并記錄每只小鼠疾病活動指數(shù)(DAI)評分，于造模第7天以脫頸法處死小鼠并分離新鮮結(jié)直腸及肝臟組織凍存用于RT-PCR檢測，或用10%甲醛固定用于蘇木精-伊紅(HE)染色、免疫組織化學(xué)及TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測；分離小鼠脾臟并稱重，評價(jià)小鼠炎癥情況。

1.2.2DAI評分、結(jié)直腸長度測量及脾臟質(zhì)量稱取 實(shí)驗(yàn)過程中每天對每組小鼠按照評分標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行DAI評分，見表1。造模第7天處死小鼠后取出回盲部至肛門的腸段及脾臟，測量整個結(jié)直腸長度，稱取脾臟質(zhì)量。

表1 小鼠糞便性狀及隱血評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3結(jié)腸病理組織評分 常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm，HE染色，中性樹膠封片后于光鏡下按照組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[11]從結(jié)腸組織炎癥程度、病變深度、隱窩損傷及上皮恢復(fù)情況進(jìn)行HE評分。

1.2.4TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測及DAB染色 常規(guī)石蠟包埋切片后鼓風(fēng)干燥機(jī)烤片90 min，使用不同濃度的二甲苯、乙醇梯度脫蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌5 min，2 次，滴加15 μg/mL Proteinase K，21～37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min，3次，滴加50 μL TUNEL反應(yīng)混合物(按Enzyme solution:Label solution=1∶9配置)，陰性對照組只滴加50 μL Label solution，濕盒中37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌5 min，3次，在組織上滴加1滴PBS，然后在熒光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長為450～500 nm，發(fā)光波長為515～565 nm)，暗綠色顆粒狀物質(zhì)即為凋亡細(xì)胞。擦干組織周圍，再滴加50 μL Converter-POD，濕盒中37 ℃孵育60 min，PBS洗5 min，3次，隨后予以DAB顯色50 s，置入自來水中終止顯色，蘇木精復(fù)染11 s，流水沖洗5 min，自然晾干，封片。顯微鏡下觀察，棕黃色顆粒為陽性，并進(jìn)行半定量積分法[12]。隨機(jī)觀察5個高倍鏡視野，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞的比例。

1.2.5RT-PCR檢測結(jié)腸組織中炎性因子及肝臟組織中F4/80的表達(dá) 于冰上制備腸及肝臟組織勻漿液；根據(jù)TRlzol試劑說明書從小鼠結(jié)腸組織中提取Total RNA，并用超微量樣品分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度；根據(jù)RNA濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，用5×Prime Script RT Master Mix試劑盒配置RT反應(yīng)液20 μL[Total RNA:1 000/Total RNA濃度(μL)、5×Prime Script RT Master Mix:4 μL，RNase Free dH2O:16-Total RNA，并將RT反應(yīng)液在GeneAmp PCR System 9700中反轉(zhuǎn)錄成cDNA；于冰上配制PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10 μL(cDNA:1 μL，TB Green Premix ExTaq Ⅱ:5 μL，β-actin-F或IL-1β-F或IL-6-F或TNF-α-F:0.4 μL，β-actin-R或IL-1β-R或IL-6-R或TNF-α-R:0.4 μL，RNase Free dH2O:3.2 μL]，在BIO-RAD(CFX Connect Real-Time System)通過RT-PCR擴(kuò)增cDNA樣品。

2 結(jié) 果

2.1腹腔注射Clodrolip有效地清除小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞 為檢驗(yàn)小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞的清除情況，使用RT-PCR檢測小鼠腸道及肝臟中F4/80的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，DSS+Clodrolip組小鼠腸組織內(nèi)F4/80相對表達(dá)水平(0.023±0.012)較DSS組(0.086±0.028)明顯降低(P=0.004)，見圖1A；DSS+Clodrolip組小鼠肝臟內(nèi)F4/80相對表達(dá)水平(0.042±0.042)較DSS組(1.068±0.127)明顯降低(P<0.01)，見圖1B。表明腹腔注射Clodrolip有效地清除了小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞。

A:腸道；B:肝臟;a:P=0.004;b:P<0.01
圖1兩組小鼠組織F4/80表達(dá)水平

2.2腹腔注射Clodrolip加重DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎 為觀察腹腔注射Clodrolip對小鼠體質(zhì)量及DAI的影響，比較兩組小鼠每天的體質(zhì)量變化率及DAI。結(jié)果顯示，從造模第4天開始，DSS+Clodrolip組小鼠體質(zhì)量變化率較DSS組明顯下降(P<0.05)，見表2；兩組小鼠DAI評分顯示造模第1天DSS+Clodrolip組小鼠率先出現(xiàn)DAI評分，從造模第4天開始，DSS+Clodrolip組小鼠DAI評分較DSS組明顯升高(P<0.05)，見表3。

表2 兩組小鼠體質(zhì)量變化率比較

表3 兩組小鼠DAI評分比較分)

2.3兩組小鼠結(jié)直腸長度以及脾臟質(zhì)量 兩組小鼠結(jié)直腸可見回盲瓣腫脹明顯，有糞便淤積，DSS+Clodrolip組小鼠結(jié)直腸長度[(5.200±0.100)cm]較DSS組[(5.925±0.443)cm]縮短(P=0.042)，見圖2。DSS+Clodrolip組小鼠脾臟質(zhì)量[(0.121±0.031)g]較DSS組[(0.068±0.011)g]增加(P=0.011)，且肉眼可見兩組小鼠脾臟大小的差異，見圖3。上述結(jié)果表明腹腔注射Clodrolip加劇了DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)直腸炎性反應(yīng)。

為了驗(yàn)證上述結(jié)論，將每只小鼠結(jié)直腸組織進(jìn)行HE染色并評分，結(jié)果顯示，DSS組小鼠結(jié)腸組織中度炎癥，病變局限在黏膜上層，可見黏膜上層炎性細(xì)胞浸潤；大部分隱窩結(jié)構(gòu)完整，可見隱窩再生現(xiàn)象；腸上皮完整，大部分組織修復(fù)。DSS+Clodrolip組小鼠結(jié)腸組織重度炎癥，病變累及黏膜下層，可見黏膜層及黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤；大部分隱窩結(jié)構(gòu)消失，偶見散在的單個隱窩，無明顯隱窩再生現(xiàn)象；腸上皮不完整，大部分腸上皮細(xì)胞破壞，無組織修復(fù)現(xiàn)象，見圖4A。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，DSS+Clodrolip組小鼠的組織學(xué)損傷評分[(14.683±1.796)分]明顯高于DSS組的(8.080±1.404)分(P=0.001)，見圖4B。表明腹腔注射Clodrolip加重了DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。

A:小鼠結(jié)直腸大體；B:小鼠結(jié)直腸長度柱狀圖;a:P=0.004 2
圖2兩組小鼠結(jié)直腸長度

2.4腹腔注射Clodrolip清除巨噬細(xì)胞增加了促炎因子的表達(dá) 小鼠HE染色結(jié)果顯示腹腔注射Clodrolip加劇了DSS誘導(dǎo)的腸道炎癥，為了探討其對結(jié)腸組織炎性因子的影響，運(yùn)用RT-PCR方法測定結(jié)直腸組織中炎性因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示DSS+Clodrolip組小鼠的IL-1β相對表達(dá)水平(1.643±0.616)高于DSS組的0.312±0.273(P=0.002)；DSS+Clodrolip組小鼠的IL-6相對表達(dá)水平(4.510±0.411)高于DSS組的0.102±0.171(P<0.01)；DSS+Clodrolip組小鼠的TNF-α相對表達(dá)水平(5.403±1.070)高于DSS組的0.494±0.167(P<0.01)，見圖5。RT-PCR結(jié)果進(jìn)一步論證了上文的觀點(diǎn)。

A:小鼠脾臟外觀；B:小鼠脾臟質(zhì)量柱狀圖；a:P=0.011
圖3兩組小鼠脾臟外觀及質(zhì)量

A:小鼠結(jié)直腸組織HE染色；B:小鼠結(jié)直腸組織的組織學(xué)損傷評分；a:P=0.001
圖4兩組小鼠HE染色病理圖片及組織學(xué)損傷評分

2.5腹腔注射Clodrolip促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡 為探究清除巨噬細(xì)胞后對小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響，使用TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測法對兩組小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行細(xì)胞凋亡熒光染色及DAB染色，結(jié)果顯示DSS+Clodrolip組小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡情況較DSS組明顯，見圖6；且DAB染色結(jié)果顯示DSS+Clodrolip組陽性細(xì)胞數(shù)量比DSS組多，見圖7。圖6示DSS+Clodrolip組小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡增多，以黏膜上皮為主，累及整個黏膜層，而DSS組凋亡相比較少，僅存在于黏膜上皮。

a:P=0.002;b:P<0.01
圖5兩組小鼠結(jié)腸組織促炎因子相對表達(dá)水平

圖6 兩組小鼠結(jié)腸組織TUNEL細(xì)胞凋亡熒光染色

圖7 兩組小鼠結(jié)腸組織TUNEL法DAB染色

3 討 論

眾多實(shí)驗(yàn)論證了免疫細(xì)胞在IBD的發(fā)病中起重要作用，如Th17細(xì)胞及其產(chǎn)生的IL-17大量存在于IBD患者腸道黏膜層，而后者則導(dǎo)致了腸黏膜的損傷，加劇了疾病的活動[13-14]。Th1的極化也與結(jié)腸炎癥有關(guān)，其主要通過誘導(dǎo)干擾素γ(IFN-γ)和TNF-α的產(chǎn)生[15]。而在免疫細(xì)胞中，腸道巨噬細(xì)胞也扮演著重要的角色，它是腸黏膜抗原呈遞細(xì)胞的主要種群，決定了T淋巴細(xì)胞對腸腔內(nèi)抗原的反應(yīng)類型[16]。巨噬細(xì)胞作為一種抗原遞呈細(xì)胞，在調(diào)節(jié)機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，且在IBD組織損傷和促進(jìn)組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用[17-18]，巨噬細(xì)胞可以通過釋放多種細(xì)胞因子和生長因子來促進(jìn)腸道黏膜的修復(fù)[19-20]。而在本實(shí)驗(yàn)中，巨噬細(xì)胞清除后，腸道黏膜損傷明顯加重，表明清除巨噬細(xì)胞后影響了其對腸道組織的修復(fù)能力，可能延緩了腸黏膜損傷的修復(fù)，表現(xiàn)為更加嚴(yán)重的腸道損傷現(xiàn)象。也有研究表明，巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞相比有更多的抗炎表型，且腸道巨噬細(xì)胞在產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的能力方面存在嚴(yán)重缺陷[21-22],這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，巨噬細(xì)胞清除后炎性因子的表達(dá)明顯升高。另外在本實(shí)驗(yàn)中，清除巨噬細(xì)胞以后，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡現(xiàn)象也顯著增加，表明巨噬細(xì)胞清除后腸道炎癥損傷加重，巨噬細(xì)胞在DSS誘導(dǎo)的UC模型中對腸黏膜起到保護(hù)作用，這也與相關(guān)報(bào)道相吻合[23]。

本研究通過腹腔注射的方法可以有效去除腸道及小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，并且多次給藥可以有效清除再生的巨噬細(xì)胞，通過RT-PCR檢測小鼠腸道及肝臟組織中F4/80的表達(dá)水平明確了成功清除巨噬細(xì)胞。通過脾臟質(zhì)量、結(jié)直腸長度、DAI指數(shù)及病理結(jié)果初步揭示了巨噬細(xì)胞清除后小鼠腸道炎癥損傷加重的現(xiàn)象。通過RT-PCR檢測小鼠腸道組織中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的相對表達(dá)水平，結(jié)果表明清除巨噬細(xì)胞明顯上調(diào)了小鼠腸道組織促炎因子的表達(dá)水平。通過TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測法進(jìn)一步揭示巨噬細(xì)胞清除后腸上皮細(xì)胞凋亡增加的現(xiàn)象。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)推測巨噬細(xì)胞在UC中具有一定的保護(hù)作用，清除巨噬細(xì)胞后促進(jìn)了UC小鼠腸道上皮細(xì)胞的凋亡及激活促炎因子的高表達(dá)來打破腸道促炎抗炎平衡，從而可能導(dǎo)致UC的發(fā)展，但其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。