基于EST-SSR熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)分析邵武碎銅茶群體遺傳多樣性與親緣關(guān)系研究

楊 軍，孔祥瑞，王讓劍，邱麗玲，鄭國(guó)華，邱陳華

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心福建分中心/農(nóng)業(yè)部福建茶樹(shù)及烏龍茶加工科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，福建 福州 350012；2.邵武農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 邵武 354000)

邵武碎銅茶又名“觀星茶”也叫“神仙茶”，為有性茶樹(shù)群體種，2009年入選為福建省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳認(rèn)定的福建省茶樹(shù)優(yōu)異種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)。其生長(zhǎng)于福建省邵武市和平鎮(zhèn)海拔1000多米的留仙峰山上，生長(zhǎng)環(huán)境多為亂石巖縫，制作成綠茶與紅茶品質(zhì)風(fēng)味獨(dú)特，取少量茶與古銅錢(qián)一起咀嚼2～3 min，能使銅錢(qián)軟化而破碎得名，被稱(chēng)為世界兩大“奇茶”之一[1]。

近些年，EST-SSR分子標(biāo)記因來(lái)自于功能基因，具有多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性好等特點(diǎn)，在資源鑒定與輔助育種中廣泛應(yīng)用[2-5]。茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析是野生茶樹(shù)種質(zhì)初步鑒定的重要手段。近些年，利用分子標(biāo)記技術(shù)分別對(duì)云南白鶯山茶樹(shù)種質(zhì)資源[6]、貴陽(yáng)花溪古茶樹(shù)資源[7]、黔南野生茶樹(shù)種質(zhì)資源[8]、香竹簧茶樹(shù)王與野生茶樹(shù)種質(zhì)資源[9]、貴州古茶樹(shù)種質(zhì)資源[10]進(jìn)行研究，結(jié)果表明云南白鶯山茶樹(shù)種質(zhì)資源亞群間存在著基因交流；貴陽(yáng)花溪古茶樹(shù)資源由喬木型向灌木型進(jìn)化；黔南野生茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳差異較大，遺傳基礎(chǔ)較寬；香竹簧茶樹(shù)王與野生茶樹(shù)、栽培型茶樹(shù)品種之問(wèn)的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；由于遺傳因素和地理位置不同引起貴州古茶樹(shù)資源的遺傳多樣性高。本試驗(yàn)對(duì)邵武碎銅茶群體進(jìn)行個(gè)體材料的親緣關(guān)系與遺傳多樣性研究，旨在對(duì)邵武茶樹(shù)種質(zhì)進(jìn)行初步鑒定，為茶樹(shù)育種、雜交親本選配提供初步依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試的29份邵武碎銅茶來(lái)自于福建省邵武市和平鎮(zhèn)留仙峰。以40個(gè)福建省茶樹(shù)良種作為對(duì)照(表1)，對(duì)照樣品采自于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所。采集各個(gè)材料一芽二葉鮮葉后用液氮迅速冷凍處理，保存在-70℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查 農(nóng)藝性狀調(diào)查參考陳亮等[11]撰寫(xiě)的《茶樹(shù)種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》。

表1 69份供試材料的名稱(chēng)與來(lái)源

1.2.2 基因組DNA的提取 采用改進(jìn)的CTAB法[12]提取茶樹(shù)基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行茶樹(shù)基因組分子量大小檢測(cè)，用756-MC型紫外分光光度計(jì)測(cè)定茶樹(shù)基因組DNA的純度(OD260/280比值)。

1.2.3 引物合成 參照文獻(xiàn)[13]引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息見(jiàn)表2。

1.2.4 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物鑒定 PCR 反應(yīng)體系為：ddH2O18.8 μL，10×Buffer2.5 μL(Mg2+)，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，上、下游primer(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL(0.5 U)，模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)于美國(guó)ABI-9600型擴(kuò)增儀上進(jìn)行，熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，然后進(jìn)入下列溫度循環(huán)：94℃變性45 s，不同溫度條件退火60 s，72℃延伸75 s，重復(fù)35個(gè)熱循環(huán)；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

引物統(tǒng)一在反向引物(R)的5′段標(biāo)記熒光(FAM/TAMRA)，由上海百力格生物科技有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物0.5 μL，GeneScanTM500 ROXTM0.5 μL，HiDi 9 μL，混勻后使用ABI公司3730XL進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用ABI公司的GeneMapper 4.0軟件，選擇GeneScanTM500 ROXTM作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每一個(gè)擴(kuò)增出的條帶記錄大小。運(yùn)用PopGen 3.2軟件計(jì)算Shannon信息指數(shù)(I)和Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)。運(yùn)用NTSYSpc2.1中的Tree plot程序進(jìn)行聚類(lèi)分析。

表2 20對(duì) SSR 引物及其序列

2 結(jié)果與分析

2.1 邵武碎銅茶葉片性狀初步調(diào)查

從表3中看出邵武碎銅茶種質(zhì)資源，葉身多為平，葉片著生狀態(tài)為稍上斜與水平，葉面以微隆起為主，葉尖以漸尖為主；調(diào)查葉片長(zhǎng)寬比值范圍在1.92～3.06，平均值為2.40，推測(cè)葉片以橢圓形為主，少量為長(zhǎng)橢圓形；葉面積平均值為17.87 cm2，為小葉種，與當(dāng)?shù)胤N質(zhì)資源描述為中葉種有所差異，葉面積大小受葉片調(diào)查代表性、調(diào)查時(shí)間與生長(zhǎng)環(huán)境氣候變化相關(guān)，推測(cè)有性邵武碎銅茶種質(zhì)資源群體為小葉種與中葉種并存。

2.2 親緣關(guān)系分析

從相似系數(shù)聚類(lèi)圖1上看出，69個(gè)參試材料分為8個(gè)類(lèi)群，除TY286、TY299、TY264外，其它邵武碎銅茶種質(zhì)資源分布于類(lèi)群A、B、C；D類(lèi)群主要為閩東地區(qū)綠茶品種資源；E類(lèi)群主要為黃棪、金牡丹等高香烏龍茶品種資源；F類(lèi)群主要為閩北烏龍茶品種資源；G類(lèi)群主要為閩南烏龍茶品種資源；H類(lèi)群主要為福云系列綠茶品種資源。從整體上看，邵武碎銅茶種質(zhì)資源與福建主要茶樹(shù)品種未聚類(lèi)在一起，分為3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的類(lèi)群。與具有云南遺傳基礎(chǔ)的福云系列品種資源相比，邵武碎銅茶跟福建省品種資源親緣關(guān)系相對(duì)較近，說(shuō)明本研究的親緣關(guān)系在一定程度上反映了不同群體資源間遺傳距離的遠(yuǎn)近。同時(shí)，邵武碎銅茶種質(zhì)資源具有獨(dú)特的遺傳背景。

表3 葉片性狀調(diào)查結(jié)果

注：農(nóng)藝性狀調(diào)查時(shí)間為8月。

2.3 群體間遺傳多樣性比較分析

從表4中看出，A-H群體中Shannon遺傳多樣性指數(shù)最高的為B、C群體，推測(cè)在群體數(shù)量差不多情況下，邵武碎銅茶種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富；Shannon遺傳多樣性指數(shù)最低的為E、F群體。Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)D主要反映Ho(觀測(cè)雜合度)和He(期望雜合度)之間的平衡關(guān)系，D值越接近0，基因型的分布就越接近于平衡狀態(tài)，D值大于0說(shuō)明存在雜合子過(guò)剩，D值小于0，說(shuō)明存在雜合子缺失現(xiàn)象[14]。類(lèi)群A、F、G的Ho與對(duì)應(yīng)的He相當(dāng)，說(shuō)明這3個(gè)類(lèi)群基因型的分布就越接近于平衡狀態(tài)；類(lèi)群B、C、D、E、H 的Ho高于對(duì)應(yīng)的He，D值大于0，雜合子過(guò)?，F(xiàn)象，尤其是類(lèi)群H的D值最大，屬于親本單一，基本遺傳背景來(lái)自與福云系列；整體邵武碎銅茶種質(zhì)資源的D值趨向0，說(shuō)明邵武資源整體基因型的分布趨向平衡，群體相對(duì)穩(wěn)定。

從群體聚類(lèi)圖2看出，同屬邵武碎銅茶種質(zhì)資源的類(lèi)群A、B、C聚類(lèi)在一起，群體遺傳背景相對(duì)一致；類(lèi)群D、E、F、G聚類(lèi)在一起，主要為福建審(鑒)定品種；H類(lèi)群主要為福云系列綠茶品種資源，與其它福建茶樹(shù)種質(zhì)資源親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，說(shuō)明其云南種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)起到一定的作用。

圖1 遺傳相似系數(shù)聚類(lèi)圖Fig.1 Dendrogram on genetic similarity

表4 對(duì)比11個(gè)群體遺傳多樣性

圖 2 群體遺傳相似系數(shù)聚類(lèi)圖Fig. 2 Dendrogram on genetic similarity of various groups

3 討論

3.1 遺傳多樣性分析

茶樹(shù)種質(zhì)資源Shannon多樣性指數(shù)是衡量茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要指標(biāo)。91個(gè)云南千家寨不同海拔野生茶樹(shù)Shannon多樣性指數(shù)為1.33[15]；廣東歷史名茶群體種曲江羅坑茶與豐順馬圖茶Shannon多樣性指數(shù)分別為1.217與1.228[16]；38個(gè)湖南黃金茶Shannon多樣性指數(shù)為0.55[17]；福建地區(qū)茶樹(shù)資源Shannon多樣性指數(shù)為1.16[18]；122個(gè)云南野生茶樹(shù)Shannon多樣性指數(shù)為0.88[19]。本試驗(yàn)計(jì)算29個(gè)邵武碎銅茶種質(zhì)資源Shannon多樣性指數(shù)為1.1298，與前人研究相比，Shannon多樣性指數(shù)高于湖南黃金茶與122個(gè)云南野生茶樹(shù)，低于廣東歷史名茶與91個(gè)云南千家寨不同海拔野生茶樹(shù)，初步鑒定說(shuō)明邵武碎銅茶種質(zhì)資源的群體遺傳多態(tài)性高，多樣性豐富。

3.2 邵武碎銅茶親緣關(guān)系分析

29個(gè)邵武碎銅茶種質(zhì)資源與參試對(duì)照福建審(鑒)定品種與地方品種均未聚類(lèi)在一起，說(shuō)明邵武碎銅茶與福建現(xiàn)有育成品種的遺傳背景差異較大，擁有相對(duì)獨(dú)立的遺傳背景，具有較強(qiáng)的育種潛力。除參試材料TY286、TY299、TY264外，邵武碎銅茶種質(zhì)資源主要分為3個(gè)群體，每個(gè)群體的農(nóng)藝性狀、生化成分、適制性茶類(lèi)等需要進(jìn)一步鑒定與觀察；參試材料整體聚類(lèi)分析初步看出，人工選育品種多聚類(lèi)在一起，比如類(lèi)群E、H，地方品種多聚類(lèi)在一起，比如類(lèi)群D、G，同時(shí)，綠茶類(lèi)型多聚類(lèi)在一起，烏龍茶類(lèi)型聚類(lèi)在一起。