ERRα通過(guò)AKT/SGK1通路抑制鹽敏感性高血壓大鼠的鹽敏感性

任 潔,胡經(jīng)文,郭統(tǒng)帥,何明俊,劉富強(qiáng),牟建軍*

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西省分子心臟病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,環(huán)境與疾病相關(guān)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710061;2陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:jjtalkong@163.com)

鹽是原發(fā)性高血壓的重要環(huán)境因素之一。大量研究表明,鹽的攝入量與心血管疾病的發(fā)生直接相關(guān)。血壓的鹽敏感性是指相對(duì)高鹽攝入所表現(xiàn)的一種血壓升高的反應(yīng)[1]。鹽敏感性高血壓可定義為相對(duì)高鹽攝入所引起的血壓升高。鹽敏感性高血壓占高血壓人群的28% -74%。不同地區(qū)和種族的人群鹽敏感性存在差異性,流行病學(xué)研究表明,血壓的鹽敏感性隨年齡增長(zhǎng)而增高。鹽敏感性高血壓患者表現(xiàn)出比心血管疾病患者更高的發(fā)病率和死亡率[2]。

雌激素相關(guān)受體(estrogen-related receptors,ERRs)屬于轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族,包括α、β和γ三種亞型[3]。已有研究發(fā)現(xiàn),ERRα與高血壓發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系,但具體影響及作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)構(gòu)建ERRα過(guò)表達(dá)大鼠模型研究ERRα對(duì)鹽敏感性高血壓大鼠血壓的影響及分子機(jī)制,為鹽敏感性高血壓治療和預(yù)防提供思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

SOD檢測(cè)試劑盒和MDA檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所),AKT抗體、p-AKT抗體、SGK1抗體和p-SGK1抗體(美國(guó)CST公司),GAPDH兔單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司),Trizol RNA提取液(美國(guó)Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司),熒光定量PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司);ERRα過(guò)表達(dá)(對(duì)照)腺相關(guān)病毒AAV9(漢恒生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡雄性Dahl鹽敏感性大鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量(150 ± 10)g,由陜西省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(陜)-2011-008。由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng),室溫(23 ± 2) ℃,相對(duì)濕度50% ,光照時(shí)間和黑暗時(shí)間各12 h。

1.3 分組、感染與造模

建立ERRα心臟過(guò)表達(dá)的大鼠模型:將24只雄性Dahl鹽敏感性大鼠分為4組,按照腺相關(guān)病毒操作說(shuō)明注射腺相關(guān)病毒,兩組為對(duì)照病毒組(Dah1-con),尾靜脈注射對(duì)照腺相關(guān)病毒,兩組為ERRα過(guò)表達(dá)組(Dah1-ERRα),尾靜脈注射ERRα過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒(200 μl、1×1012v. p. )。大鼠被注射病毒3周,然后通過(guò)Q-PCR檢測(cè)ERRα表達(dá)。

鹽敏感性高血壓造模:分別取一組ERRα過(guò)表達(dá)及其對(duì)照Dahl大鼠各6只(正常鹽對(duì)照組和正常鹽ERRα過(guò)表達(dá)組),給予正常鹽喂食(含氯化鈉0.5%飼料),另取一組ERRα過(guò)表達(dá)及其對(duì)照Dahl大鼠各6只(高鹽對(duì)照組和高鹽ERRα過(guò)表達(dá)組),給予高鹽喂食(含氯化鈉8%飼料)。喂食大鼠3周,然后檢測(cè)各組大鼠造模前后血壓和血漿醛固酮水平。

1.4 血壓檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)前后采用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈測(cè)壓儀測(cè)定Dah1大鼠血壓。大鼠放入固定儀后,將鼠尾套入無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x,然后在37 ℃下預(yù)熱10-15 min,記錄大鼠尾動(dòng)脈血壓。重復(fù)測(cè)量3次,取平均值。取收縮壓(mmHg)作為檢測(cè)指標(biāo)。

1.5 血漿抗氧化水平的檢查

不同鹽度的飼料喂食大鼠3周,腹腔注射2.5 ml/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采集腹主動(dòng)脈血液3 ml,離心(2 500 r/min,10 min),取上清,-20 ℃保存。按照試劑盒說(shuō)明書(shū),檢測(cè)各組大鼠血清中SOD和MDA的含量。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

不同鹽度的飼料喂食大鼠3周,迅速分離大鼠主動(dòng)脈血管,加入液氮碾磨,總RNA提取采用Trizol法,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄,定量PCR采用SYBR Green染料法進(jìn)行,根據(jù)SYBR Premix Ex Taq熒光定量試劑盒制造商說(shuō)明配制PCR體系并在LightCycler?480實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上運(yùn)行,PCR反應(yīng)采用兩步法,反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參,根據(jù)Ct值計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量。每組3個(gè)復(fù)孔,3次重復(fù)。引物序列見(jiàn)表1。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

不同鹽度的飼料喂食大鼠3周,迅速分離大鼠胸主動(dòng)脈組織放于液氮,置于冰上碾磨勻漿,裂解細(xì)胞后使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行定量,取總蛋白(25 μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入一抗SGK1(1 ∶500)、p-SGK1(1 ∶500)、AKT(1 ∶500)、p-AKT(1 ∶500),4 ℃孵育過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000),室溫孵育45 min,洗滌后加入顯色液顯色,ImageJ2x軟件用于灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異比較,單因素方差分析進(jìn)行多組差異比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高鹽誘導(dǎo)鹽敏感性高血壓大鼠血壓升高

血壓檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常鹽對(duì)照組大鼠相比,高鹽對(duì)照組大鼠血壓明顯升高(見(jiàn)圖1)。表明高鹽能夠誘導(dǎo)鹽敏感性高血壓大鼠血壓升高,鹽敏感性高血壓造模成功。

與正常鹽對(duì)照組比較,* *P<0.01圖1 高鹽誘導(dǎo)鹽敏感性高血壓大鼠血壓升高Figure 1 High salt elevates blood pressure in salt-sensitive hypertensive rats

2.2 高鹽抑制ERRα mRNA表達(dá)

熒光定量PCR檢測(cè)了高鹽誘導(dǎo)鹽敏感性高血壓大鼠中ERRα mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,與正常鹽對(duì)照組比較,高鹽對(duì)照組高血壓大鼠胸主動(dòng)脈ERRα mRNA表達(dá)顯著降低(見(jiàn)圖2)。

與正常鹽對(duì)照組比較,* *P<0.01圖2 高鹽抑制鹽敏感性高血壓大鼠ERRα mRNA表達(dá)Figure 2 High salt inhibits ERRα mRNA expression in salt-sensitive hypertensive rats

2.3 ERRα降低鹽敏感性高血壓大鼠血壓

血壓檢測(cè)結(jié)果表明,與高鹽對(duì)照組比較,高鹽ERRα過(guò)表達(dá)組大鼠血壓顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖3)。

2.4 ERRα抑制鹽敏感性高血壓大鼠氧化應(yīng)激水平

檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常鹽對(duì)照組比較,高鹽對(duì)照組大鼠SOD活力顯著降低,MDA含量顯著升高。與高鹽對(duì)照組比較,高鹽ERRα過(guò)表達(dá)組大鼠SOD活力顯著升高,MDA含量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖4)。

2.5 ERRα激活A(yù)KT/SGK1通路

Western blot研究結(jié)果顯示,高鹽ERRα過(guò)表達(dá)組大鼠AKT磷酸化和SGK1磷酸化水平均明顯高于高鹽對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖5)。

與高鹽對(duì)照組比較,* *P<0.01圖3 ERRα過(guò)表達(dá)抑制高鹽誘導(dǎo)的高血壓Figure 3 ERRα overexpression inhibits high salt-induced hypertension in salt-sensitive hypertensive rats

與高鹽對(duì)照組比較,* *P<0.01圖4 ERRα對(duì)大鼠血清SOD和MDA含量的影響Figure 4 Effect of ERRα on serum SOD and MDA levels in salt-sensitive hypertensive rats

與高鹽對(duì)照組比較,* *P<0.01圖5 ERRα促進(jìn)鹽敏感性高血壓大鼠AKT與SGK1磷酸化Figure 5 ERRα promotes the phosphorylation of AKT and SGK1 in salt-sensitive hypertensive rats

3 討論

隨著人口增長(zhǎng)以及人口老年化,高血壓、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化等代謝性病發(fā)病率逐年升高,并且增加了心臟病誘發(fā)和惡化的幾率。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球范圍內(nèi)大約有11億高血壓患者,且呈現(xiàn)出逐年增多的趨勢(shì)[4]。高血壓的主要特征表現(xiàn)為動(dòng)脈血壓增高,同時(shí)可能伴有多器官功能性損害,因此高血壓也是心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素。因此,降低血壓的同時(shí),預(yù)防和控制引起血壓升高的危險(xiǎn)因素或疾病是目前高血壓治療的主要方向[5]。

ERRα是轉(zhuǎn)錄因子核受體超家族一員。ERRα主要分布在心臟、腎和脂肪組織等代謝活躍的組織器官中,主要通過(guò)調(diào)控氧化磷酸化基因的轉(zhuǎn)錄,對(duì)葡萄糖、脂肪等物質(zhì)能量代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)[6]。大量研究表明,ERRα與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),ERRα在乳腺癌、宮頸癌和結(jié)直腸癌等中高表達(dá)[7,8]。有研究表明,ERRα與鹽敏感性高血壓的發(fā)生有關(guān),可能與ERRα調(diào)節(jié)β-ENaC和γ-ENaC的表達(dá)有關(guān)[9]。本研究通過(guò)高鹽誘導(dǎo)鹽敏感性高血壓大鼠模型,熒光定量PCR檢測(cè)ERRα在高鹽誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠中的表達(dá),結(jié)果表明,ERRα在高鹽誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠中低表達(dá)。過(guò)表達(dá)ERRα能夠顯著抑制大鼠血壓的升高。揭示ERRα可能與鹽敏感性高血壓大鼠高血壓的發(fā)生有關(guān)。

氧化應(yīng)激是體內(nèi)活性氧介質(zhì)ROS活性過(guò)強(qiáng)的一種狀態(tài),與高血壓等代謝性疾病密切相關(guān)。在高血壓狀態(tài)下,體內(nèi)氧化平衡被打亂,SOD等抗氧化酶表達(dá)減少,導(dǎo)致ROS積累增多,從而引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的增加,脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物又能進(jìn)一步加重氧化損傷[10]。有研究表明,氧化應(yīng)激可能是鹽敏感性高血壓的一個(gè)決定因素,高鹽誘導(dǎo)鹽敏感性高血壓產(chǎn)生時(shí),伴隨血液和腎臟系統(tǒng)氧化應(yīng)激水平的升高,通過(guò)藥物抑制腎臟的氧化應(yīng)激水平緩解腎損傷能夠有效地緩解高血壓的損傷[11]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高鹽高血壓模型組大鼠主動(dòng)脈中SOD活性顯著降低,MDA水平升高,表明高鹽誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓可能與主動(dòng)脈氧化損傷有關(guān),這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致。過(guò)表達(dá)ERRα能夠提高高血壓大鼠血液SOD活性,抑制MDA水平,從而抑制血壓的升高,證實(shí)提高機(jī)體抗氧化能力并抑制機(jī)制氧化應(yīng)激水平,能夠緩解高血壓的損傷,這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致。

Akt通路或PI3K/Akt通路是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的一條重要通路。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,激活的Akt通過(guò)磷酸化一系列細(xì)胞內(nèi)蛋白介導(dǎo)下游反應(yīng),這些反應(yīng)包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移和血管生成。血清/糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1(SGK1)是AKT下游重要的靶點(diǎn)之一。研究表明,17β-雌二醇能夠激活PI3K/AKT/SGK1通路,抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[12]。本研究中,ERRα促進(jìn)了AKT的磷酸化水平,激活了AKT/SGK1信號(hào)通路,提升SOD活性,抑制MDA水平,提高機(jī)體抗氧化能力,從而緩解高血壓的損傷。ERRα是如何通過(guò)AKT/SGK1信號(hào)通路還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證明。

總之,本研究建立了高鹽誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠模型,通過(guò)構(gòu)建ERRα高表達(dá)大鼠模型,對(duì)ERRα與鹽敏感性高血壓和氧化應(yīng)激之間的關(guān)系進(jìn)行初探,為下一步深入研究提供參考依據(jù),為ERRα在鹽敏感性高血壓的發(fā)生和預(yù)防中的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。